193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 és az érett fehérje első négy aminosavára kódol. Ezt a kis fragmenst ezután arra használtuk, hogy a pPLa-HFIF-67-12A19 plazmid Hpal-EcoRI fragmensébe (amelyben a Hpal hely a G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidból a fent leírt módon történt deléció következményeképpen jött létre) helyezzük, a Hpal-EcoRI-resztrignált pPLa-HFIF-67-12A19-nek e fragmenssel T4 DNS-ligáz jelenlétében történő kapcsolása útján. A PstI (tompavégűsített) -Hpal kötésnél előre várhatóan kialakult szekvencia tehát a következő: (ß-laktamäz szignál-peptidet kódoló szekvencia)-CAC.CGC.AAC.AUG-(HuIFN-ß szignál- His - Arg - Asn - Met-peptidet kódoló szekvencia)-AUG-(érett HuIFN-ß-kodolo szekvencia). így tehát a felépítés eredményeképpen a következő szerkezetet kapjuk: az IFN-ß előtt két szignál-szekvencia áll tendemben, egy bakteriális szignál-szekvencia (ß-laktamäz) és az IFN-ß szignál-szekvencia, amelyeket néhány aminosav köt össze egymással. Ezért ez a szerkezet képes lehet a két szignál-peptiddel összekötött érett HuIFN-ß exprimálására; vagy ha a bakteriális szignál-szekvencia és a HuIFN-ß szignál-szekvencia tendem-kombinációját a baktériumok felismerik és helyesen hasítják, akkor ez a szerkezet képes lehet az érett HuIFN-ß exprimálására és a sejtből való kiválasztására. E. coli M5219 törzset transzformáltunk a pPLa-HFIF-67- 12A279T-vel. 6. A G-pPLa-HFIF-67- 12A218M1 plazmid felépítése A pKT218 plazmidot (K- Talmadge id. h. ismertetett módon előállítva; a pKT218 plazmid a pBR322 oly származéka, amelyben a ß-laktamäz génjének egy része és ennek szignál-szekvenciája deléció folytán hiányzik és amelynek a ß-laktamäz szignál-szekvenciája 4. aminosavánál kialakított PstI helye van) EcoRI és Alul emésztő enzimmel kezeltük, hogy így egy olyan fragmenst képezzünk, amely többek között a ß-laktamäz szignál-peptid kezdeti részére kódol. Ezt a fragmenst T4 DNS-ligáz jelenlétében kapcsoltuk a pPLa-HFIF-67-12A19 Alul emésztő-enzimmel 0,05 mmol/1 aktinomicin D jelenlétében való kezelés és EcoRI-vel való resztrikció útján előállított fragmenssel (az aktinomicin D-t a fenti kezelés során abból a célból alkalmaztuk, hogy ezáltal resztringáljuk a plazmidot az IFN-ß szignál-peptid Alul helyénél). A kapott plazmid, amelyet pPLa-HFIF-67-12A218M1 plazmidnak neveztünk el a ß-laktamáz szignál-peptidre kódoló gén kezdeti részét, aHuIFN-ß-ra kódoló szignál-peptidre kódoló gén egy részét és az érett HuIFN-ß-ra kódoló gént tartalmazta. A plazmid, vonatkozó tartományának előre megjósolt szekvenciája a következő: 49 26 IÎ-----CAA GCU.CUU.UCC.AUG-(érett HuIFN-ß- Gln - Ala - Leu - Ser - Met -50 -kódoló szekvencia) A bekeretezett szám a pKT218 plazmid ß-laktamäz szignál-peptidjében levő aminosav-maradékok számát jelzi. Ezért ez a szerkezet lehetővé teheti az egy bakteriális szignál-szekvencia egy részéhez és a saját szignál-szekvenciája egy részéhez kötött érett HuIFN-ß expresszióját. Itt is, ha a gazda-baktérium felismeri és helyesen hasítja a hibrid szignál-szekvenciát, akkor érett HuIFN-ß lesz exprimálható ebből a plazmidból és kiválasztható a sejtből. E. coli M5219-et transzformáltunk a pPLa-HFIF-67-12A218Ml-gyel. 7. A G-pPLa-HFIF-67-12AMl plazmid felépítése. A pPLa-HFIF-67-12A19 plazmidot a fentebb leírt módon linearizáltuk Alul enzimmel 0,05 mmol aktionimicin D jelenlétében, hogy egy metszést hozzunk létre az Alul helyen a HuIFN-ß szignál-peptidjében. Hpal enzimmel való kezelés után a DNS-recirkularizáltuk T4 DNS ligáz jelenlétében. A kapott plazmid, amelyet pPLa-HFIF-67-12AMl-nek neveztünk el, az érett IFN-ß-ra kódoló DNS-szekvenciát megelőző IFN-ß szignál-szekvenciának csak egy kis részét tartalmazta. A kapcsolat előre látott szekvenciája a következő: 82 GUU CUC.UUU.CCA.UGA. Val - Leu - Phe - Pro - STOP * 8 A UG-(érett HuIFN-ß-kodolo szekvencia! A függőlegesen bekeretezett szám a ß-laktamázban jelenlevő aminosav-maradékok számára utal. A vízszintesen bekeretezett rész a második leolvasó-fázisban levő szekvenciát mutatja. Ezért a ß-laktamäz-kodoló szekvencia és a HuIFN-ß szignál-pep tidjére kódoló szekvencia fennmaradó részének a transzlációja meg van állítva az UGA-stop kodonnál. Az érett IFN-ß start-kodonja (AUG) azonban jelen van ugyanazon a helyen, bár egy másik, különböző leolvasó fázisban. Ezért a transzláció újra kezdődhet ezen a ponton, hogy érett HuIFN-ß-t hozzon létre. E. coli M5219 törzset transzformáltunk a pPLa-HFIF-67-12AMl plazmiddal. 8. A G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2 plazmid felépítése. A pPLa-HFIF-67-12Á19 plazmidot Hpal enzimmel linearizáltuk és BAL 31 exonukleazzal kezeltük, hogy bázis-párokat távolítsunk el sorozatosan a linearizált DNS-frag.mens végéről [H. Gray és munkatársai: „Extracellular Nucleases of Pseudomonas Bal 31" 1. Characterization of Single Strand-Specific Deoxyribendonuclease", Nucleic Acids Res., 2, 1459—1492 (1975)]. Az exonukleázzal va-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
