193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 két alakít ki, vő.: R. Wang és munkatársai, Biochim. Biophis. Acta, sajtó alatt), majd alacsony DNS-koncentrációnál ismét kapcsoltuk. Az eredeti G-pPLa-HFIF-67-12 két XorlI helyet tartalmazott: az egyik hely inaktiválja a kanamicin-gént, a másik pedig a plazmidból eltávolítandó Hindi fragmensben van. Az XorlI enzimmel történő kezelési és újrakapcsolási lépésnek az a célja, hogy kiküszöböljük a Hindi enzim által nem hasított eredeti DNS-molekulákat. Az ilyen molekulákban két XorlI hely van és a kapcsolás során' alkalmazott körülmények között a két fragmens újbóli egyesülése igen valószínűtlen. Transzformánsokat CóOOnTm^ (A,)-ban kaptunk, ezeket kanamicinre szelektáltuk és resztrikciós analízis útján szűrővizsgálatnak vetettük alá őket egyetlen Pvul helyet tartalmazó transzformánsok kiszűrésére. A kiónok további analízisét Hindi enzimmel való kezeléssel végezték. Egy olyan kiónt találtunk, amelyből hiányzott a legkisebb Hindi fragmens, de egyébként azonos volt a G-pPLa-HFIF-67-12 plazmiddal, ezt G-pPLa-HFIF-67-12A19-nek neveztük el. Az e plazmid felépítése során alkalmazott lépéseket vázlatosan a 9. ábra szemlélteti. E plazmid részletesebb térképe a 12. ábrán látható. A plazmid méretét (körülbelül 4050 bázis-pár) az őt alkotó fragmensek méretének összegezése útján becsültük meg; a fragmensek méretét viszont az agaróz-gélen végzett elektroforézis során mutatottt viszonylagos motilitásuk alapján becsültük. Ezután az E. coli K12AHI és M5219 törzseket transzformáltuk a fentiekben jellemzett G-pPLa-HFIF-67-12A19 plazmiddal. 4. A G-pPLc-HFIF-67-8 plazmid felépítése A G-pPLc24 plazmid egy másik lehetőséget nyújt HuIFN-ß szekvenciáknak oly módon történő’beiktatására, hogy ezzel egy másik fúziós polipeptid legyen szintetizálható. A G-pPLa-HFIF-67-1 plazmidból származó BglII fragmensnek a G-pPLc24 plazmid BamHI helyére történő beiktatása egy folytonos leolvasó-fázist eredményez, amely az MS2 replikáz-génből származó 98 aminosav-maradékra kódol [W. Fiers és munkatársai: „Complete Nucleotide Sequence of Bacteriophage MS2 RNA: Primary and Secondary Structure of the Replicase Gene", Nature, 260, 500—507 (1976)] és amelyhez a BglII hely és a HuIFN-ß szignál-szekvenciájának kezdő AUG csoportja között helyet foglaló, 27 aminosav-máradékra kódoló szekvencia csatlakozik és ezt a HuIFN-ß szignál-peptid és az érett HuIFN-ß kódoló szekvenciája követi: 47 98 UUG GAU.CUU.CAG.UUU.CGG.AGG.CAA. Trp - Asp - Leu - Gin - Phe - Arg - Arg - Gin -CCU.UUC.GAA.GCC.UUU.GCU.CUG.GCA. Pro - Phe - Glu - Ala - Phe - Ala - Leu - Ala -CAA.CAG.GUA.GUA.GGC.GÀC.ACU.GUU. Gln-Gln - Val - Val - Gly - Asp - Thr - Val -CGU.GUU.GUC.AAC.AUG- (HuIFN-ß szig- Arg - Val - Val - Asn - Met nál-peptidre kódoló szekvencia)-AUG-(érett kódoló szekvencia). A bekeretezett szám az MS2 repiikáz •gén-fehérjében levő aminosav-maradékok számát mutatja (R. Devos és munkatársai fent idézett munkája: W. Fiers és munkatársai idézett munkája). Ezért ez a szerkezet képes lehet egy olyan kapcsolt polipeptid exprimálására, amely az MS2 repiikáz egy részéből, a 27 aminosavon keresztül ezzel összekötött HuIFN-ß szignál-peptidből és az utóbbival összekötött érett HuIFN-ß-bol áll. A G-pPLa-HFIF-67-1 DNS-t BgHI emésztő enzimmel, kezeltük,majd kapcsoltuk a BamHI enzimmel hasított G-pPLc24 DNS-sel. A kapcsolási elegyet újból hasítottuk BamHI-vel.hogy kiküszöböljük a reagálatlan pPLc24 molekulákat,majd CéoOr^mJ (Á)-ba transzformáltuk, karbenicilinnel szembeni rezisztencia alapján szelektálva. A transzformánsokat HincII-vel való resztrikció útján analazáltuk. A pPLc24 resztrikció-helyeinek ismert helyzete alapján várható, hogy a BglII-IFN-ß fragmensnek a I£ irányában orientait értelmű beiktatása egy körülbelül 650 bázis-párból álló extra Hindi fragmenst hozzon létre. Egy e konfigurációt mutató reprezentatív kiónt pPLc-HFIF-67-8 megjelöléssel láttuk el. Az e plazmid felépítése során alkalmazott lépéseket vázlatosan a 10 ábra mutatja. E plazmid részletesebb térképe a 13. ábrán látható. A plazmid méretét (körülbelül 3850 bázis-pár) az őt alkotó fragmensek méretének öszszegzése alapján becsültük, míg a fragmensek méretét agaróz-gélen végzett elektroforézis során mutatott mobilitásuk alapján állapítottuk meg. E. coli K12AHI és M5219 törzseket transzformáltunk a fenti módon jellemzett G-pPLc-HFIF-67-8 plazmiddal. 5. A G-pPLa-HFlF-67-12A279T plazmid felépítése A pKT279 plazmidot (K. Talmadge Eukaryotic Signal Sequence Transports Jusulin Antigen in E. coli, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 77, 3369—73 helyen ismertetett módon pBR322- ből előállítva; a pKT279 plazmid a pBR322 plazmid oly származéka, amelyben a ß-laktamáz génjének egy része deléció folytán hiányzik és egy PstI hely van benne a ß-laktamáz 2. aminosavánál kialakítva) PstI emésztő-enzimmel kezeltük, majd a 3’-terminális extenziót eltávolítottuk és a fragmenst tompavégűvé alakítottuk E. coli DNS-polimeráz I enzimmel való kezelés útján (Klenov-fragmens) dezoxinukleozid-trifoszfátok jelenlétében. A pKT279 plazmid Pstl-linearizált és 3’-tompavégű DNS-fragmensét azután EcoRI emésztő-enzimmel kezeltük, hogy így egy oylan fragmenst állítsunk elő, amely többek között a ß-laktamäz szignál szekvenciájára 48 25 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
