193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 fel tudja ismerni [V. Pirotta, „Two Restriction Endonucleases from Bacillus globigii”, Nucleic Acids Res., 3, 1747—1760 (1976)]. A ligáció megtörténte után az elegyet ismét hasítottuk BamHI enzimmel, az egyszerűen recirkularizált G-pPLa8 molekulák eltávolítása céljából. Transzformánsokat ismét C600rKm^ (X) törzsben kaptunk, kanamicin-rezisztencia alapján szelektálva. A transzformált agaróz-gélen, a hasítatlan DNS méret-meghatározása alapján történő szűrővizsgálatnak vetettük alá, a fentebb, az IFN-ß-rokon rekombináns plazmidok jellemzése esetében leírt módszerrel. Azokat a kiónokat, amelyek az eredeti G-pPLa8- nál valamivel nagyobbaknak bizonyultak, további resztrikciós analízisnek vetettük alá, Pstl vagy Hindi alkalmazásával. Egy olyan kiónt találtunk, amely egyetlen Pstl helyet és három Hindi helyet tartalmazott. E klón egy fragmense együtt migrált a Ç-tői a ß-laktamázig terjedő tartományból származó pPLa8 egyik Hindi fragmensével. A klón egy másik kis fragmense körülbelül 400 bázis-párt tartalmazott, összhangban a BglII fragmensnek a G-pPLa8-ba a Ç promotor irányában orientáltan történő beiktatásával. Ezt a plazmidot G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidnak neveztük el. Az e plazmid felépítése során alkalmazott lépéseket vázlatosan a 9. ábrán szemléltetjük. E plazmid részletesebb térképét a 11. ábra mutatja. A plazmid méretét (körülbelül 4450 bázis-pár) az alkotó fragmensek mérete alapján becsültük, ez utóbbiakat pedig az agaróz-gélen végzett elektroforézis során mutatott viszonylagos mozgékonyság alapján történő becsléssel állapítottuk meg. Ezután E. coli K12AHI és M5219 törzseket transzformáltuk a fentiekben jellemzett G-pPLa-HFIF-67-12 plazmiddal. A G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidban a BglII/BamHI kötés körüli meghatározott nukleoiid-szekvencia vizsgálata egy érdekes vonást derített fel. Az e plazmid ß-laktamäz-kódoló szekvenciájának AUG csoportjánál iniciált polipeptid egy oly kettős amber kodonnál végződik, amely a HuIFN-ß-ra kódoló szekvencia lefordítatlan 5’-végén belül helyezkedik el. Ezek a terminációs kodonok 23 nukleotiddal a HuIFN-ß szignál-peptid iniciáló AUG csoportja előtt helyezkednek el, a következő módon („am" jelentése: amber kodon) : BamHI/BglII kötés .CGG.AUC.UUC.AGU.UUC.GGA.GGC. Arg . Ile - Phe - Ser - Phe - Gly - Gly -45 AAC.CUU.UCG.AAG.CCU.UUG.CUC.UGG. Asn - Leu - Ser - Lys - Pro - Leu - Leu - Trp -CAC.AAC.AGG.UAG.UAG GCGACACUGUHis - Asn - Arg am am UCGUGUUGUCAAC 24 CCC Pro 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 AUG-(HuIFN-ß szignál-peptidre kódoló szekvencia)-AUG-(érett HuIFN-ß-ra kódoló szekvencia) . A bekeretezett szám a pBR322 ß-laktamäz fehérében levő aminosav-maradékok számára utal (J. Sutcliffe fentebb idézett munkája). A csillag (*) azt jelzi, hogy a pBR322- ben az e helyzetben jelenlevő CCU kodon CCC- re változott, annak következtében, hogy a pPLa2311-ben levő Pstl hely a pPLa8-beli BamHI hellyé alakult át (lásd fentebb). Ezért ez a felépítés megnyitja a HuIFN-ß szignál-peptid AUG csoportjánál történő reiniciáció lehetőségét és ezért szignál-peptidjéhez kötött, de a ß-laktamäz valamely részéhez nem kötött IFN-ß expressziójának lehetőségét is. Ilyen, az idő előtti terminációt követő belső reiniciációt figyeltek meg az E. coli laktóz operon represszor génjében [ T. Platt és munkatársai: „Translational Restarts: AUG Reinitiation of a lac Repressor Fragment", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 69, 897— 901 (1972) ]. Ez a felépítés lehetővé teheti érett HuIFN-ß extrécióját a HuIFN-ß szignál-szekvencia helyes bakteriális felismerése útján. 3. A G-pPLa-HFIF-67-12A19 plazmid felépítése A pBR322 ismert szekvenciája és a HuIFN-ß-kodolo szekvencia ismerete alapján levezethető, hogy a kis Hindi fragmensnek a G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidból (a ß-laktamáz belsejétől 3 nukleotiddal az AUG csoportot iniciáló hUIFN-szignái-peptid előttig) való deléciója egy folytonos transzlációs leolvasó-fázist eredményez, amely a ß-laktamäz AUG csoportjánál kezdődik és a HuIFN-ß-kódoló szekvencia után végződik. Erről a szerkezetről tehát megjósolható, hogy egy oly polipeptidre kódol, amely a ß-laktamäz-kódoló szekvencia 82 aminosav-maradékából, egy az összekapcsolt Hindi helyen kódolt aminosavból, aHuIFN-ß szignái-peptidből és az érett HuIFN-ß-kodolo szekvenciá- 1, vagyis az alábbi felépítésű: AAC.AUG-(HuIFN-ß szignál-peptid kó- Asn - Met doló szekvencia) AUG (érett HuIFN-ß-kodolo szekvencia) A bekeretezett szám a pBR322 ß-laktamáz-fehérjében levő aminosav-maradékok számára utal (vö.: J. Sutcliffe fentebb idézett munkája). Ezért ez a szerkezet képes lehet egy olyan egyesített polipeptid exprimá’ására, amely a ß-laktamäz egy részéből, az ehhez egy aminosavon keresztül kapcsolt HuIFN-ß szignál-peptidből és az ehhez kapcsolódó érett HuIFN-ß-bol áll. Egy ilyen fúziós fehérje kiválasztódhat a sejtből. A G-pPLa-HFIF-67-12 plazmidot részlegesen lebontottuk Hindi enzimmel való kezelés útján. A körülbelül 0,01 pg/ml DNS- koncentrációnál történő kapcsolás után a DNS-t XorlI alkalmazásával hasítottuk (ez a Pvul izoszkizomerje, amely kiálló 3’-vége-46 bol á 82 GUU Val -
