193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 dal transzformált F coli gazdák az ilyen antibiotikumot tartalmazó kultúrában jól fejlődnek, az ily módon nem transzformált baktériumok kizárásával. Ezért a tetraciklin-tartalmú kultúrában történő tenyésztés lehetővé teszi a rekombináns DNS-molekulával vagy reciklizált vektorral transzformált gazdák szelekcióját. 37°C hőmérsékleten történő 24 órai inkubálás után az egyes kolóniákat kiemeltük és a fentiekhez hasonló, tetraciklin-tartalmú LB közeg 100 pl-jében szuszpendáltuk őket, Dynatech-féle mikroliter-lemezek üregében. A lemezeket éjjelen át 37°C hőmérsékleten inkubáltuk, majd mindegyik üreg tartalmához 1 I pl dimetil-szulfoxidot kevertünk és a tálcákat ragasztószalaggal lezártuk. Az így elkészített lemezeket —20°C hőmérsékleten tároltuk; ily módon egy 17 000 transzformált E. coli HB101 egyedi kiónt tartalmazó „könyvtárat" állítottuk elő. Ez a „könyvtár" 270 fmol (128 ng) dT-farok-részű cDNS-betétből származik; ez utóbbiakat viszont 4,4 pg grádienssel tisztított poli (A) RNS-ből szintetizáltuk. E „könyvtár" kiónjainak körülbelül 98%-a érzékeny volt karbenicilinnel (ez az ampicillin egy stabilabb származéka) szemben. Ezért a „könyvtár" körülbelül 98%-a oly plazmidot tartalmaz, amelynek a Pstl helyen a pBR322 P-laktamáz-génjéből betétje van és csupán 2% tartalmaz ilyen betét nélküli reciklizált vektort. Ez a 17 000 klón számos különböző rekombináns DNS-molekulát tartalmaz, amelyek a HuIFN-ß-termelö sejtekből származó poli (A) RNS-ben levő mRNS-ek elegyének teljes vagy részleges kópiáit képviselik. Ezek többsége csupán egyetlen rekombináns DNS-moiekulákat tartalmaz. E rekombináns DNS-molekuiából csak néhány áll rokonságban a HuIFN-ß-val. így tehát ezeket a kiónokat még szűrésnek kell alávetni, hogy elkülönítsük a HuIFN-ß-rokon kiónokat a többiektől. A HuIFN-ß cDNS-t tartalmazó klón kiszűrése Különböző módszerek vannak a HuIFN-ß cDNS-t tartalmazó bakteriális kiónok kiszűrésére. Ilyen módszer például a DNS szelektáló hibridizációja (vö.: Alwine és munkatársai fentebb idézett munkája), a differenciális hibridizáció [T. P. St. John és R. W. Davis: „Isolation of Galactose-Inducible DNA Sequences from Saccharomyces Cerevisiae by Differential Plaque Filter Hybridization”, Cell 16, 443—452 (1979)], hibridizálás szintetikus mintával [B. Noyes és munkatársai: „Detection and Partial Sequence Analysis oi Gastrin mRNA by Using an Oligodeoxynuclaotide Probe", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 1770—1774 (1979)] vagy az olyan kiónok kiszűrése immunológiai [L. Villa-Komaroff és munkatársai: „A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 3727—3731 (1978)] vagy biológiai [A. C. Y. Chang és munkatársai: „Phenotypic 2b 14 Expression in E. coli of a DNA Sequence Coding for Mouse Dihydrofolate Reductase", Nature, 275, 617—624 (1978)] módszerekkel, amelyek a kívánt fehérjét termelik. A RNS-szelekciós hibridizálást választottuk, minthogy ez a legkényelmesebb és a leginkább eredményt ígérő módszer a primer szűrővizsgálat céljaira. A) RNS-szelekciós hibridizálási vizsgálat 1. A kezdeti vizsgálat áttekintése Most a 2. ábrára utalva ismertetjük a rekombináns DNS-molekulák elkülönítését a fent említett klón-könyvtárból származó körülbelül 46 karbenicillinre érzékeny és tetraciklinnel szemben rezisztens klón egyedi kultúráiból („A” lépés; a 2. ábrán két klón két elegyét mutatjuk be). A rekombináns DNS-molekulákat hasítottuk és olyan teljes RNS-sé hibridizáltuk őket, amely tartalmazza a fentebb leírt módon előállított HuIFN-ß mRNS-t („B" lépés). Valamennyi rekombináns DNS-molekula — teljes RNS hibridet elkülönítettük a nem hibridizált teljes RNS-től („C" lépés). A hibridizált teljes RNS-t kinyertük a hibridekből és tisztítottuk őket („D” lépés). A kinyert RNS-t a fentebb leírt módon vizsgáltuk HuIFN-ß mRNS aktivitásra („E" lépés). Ha és csakis a rekombináns DNS-molekulák elegye tartalmaz egy olyan rekombináns DNS-molekulát, amelynek van olyan beiktatott nukleotid-szekvenciája, amely képes szigorú hibridizációs feltételek között a HuIFN-ß mRNS-re hibridizálni a teljes RNS- ben, akkor az e hibridből felszabadított mRNS HuIFN-ß képződését fogja oocitákban előidézni, minthogy a bármely más rekombináns DNS -molekula — teljes RNS hibridből felszabadított mRNS nem mutat IFN-ß-rokonsägot. Ha egy 46 klónból álló csoport pozitív reakciót adott, akkor e kiónokat 6 alapcsoportba osztottuk (4 alcsoport 8—8 klónnal és 2 alcsoport 7—7 klónnal) és mindegyik alcsoportot újra vizsgáltuk a fenti módon. Ezt az eljárást addig folytattuk, míg egyetlen olyan kiónt tudtunk azonosítani, amely pozitív reakciót ad e vizsgálatban. Nincsen biztosíték arra, hogy akár a rekombináns DNS-molekulák, akár az általuk transzformált baktérium-kultúrák, amelyeket a fenti módon azonosítottunk, valóban tartalmazzák a teljes IFN-ß cDNS-szekvenciát, vagy akárcsak arra sem, hogy a DNS-szekvencia valóban kódol IFN-ß-ra vagy lehetővé teszi, hogy a klón az IFN-ß immunológiai vagy bakteriológiai aktivitását mutató peptideket exprimáljon. A rekombináns DNS-molekulák azonban bizonyára tartalmazni fognak az IFN-ß mRNS-t kódoló szekvenciával komplementer terjedelmes nukleotidokat. Ezért a rekombináns DNS-molekula legalább forrásként használható olyan mintához, amely más rekombináns DNS-molekulák és ezekkel transzformált kiónok gyors szűrővizsgálatára, hogy így azonosíthassuk további olyan klón-csoportokat, amelyek eset-26 5 13 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
