193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
leg tartalmaznak egy autentikus vagy teljes IFN-ß nukleotidot kódoló szekvenciát. Ezeket a kiónokat azután analízisnek vethetjük alá, hogy képesek-e exprimálni az IFN-ß biológiai vagy immunológiai aktivitását mutató polipeptideket. Az ilyen hibrid plazmidok beiktatott DNS-fragmensének a nukleotid-szekvenciáját és aminosav-transzlációs termékét azután meghatározhatjuk és — amenynyiben lehetséges — korrelációba hozhatjuk az autentikus IFN-ß aminosav-összetételével és kezdeti szekvenciájával (lásd fentebb). 2. A kezdeti vizsgálat kivitelezése „A" lépés: A rekombináns DNS-molekula-elegy előállítása A fenti klón-könyvtárból származó 96 kiónt tartalmazó mikrotiter-lemezről másolatokat készítettünk oly LB-ágár lemezeken, amelyek egyike 10 pg/ml tetraciklint, másika pedig 100 pg/ml karbenicillint tartalmazott. Ily módon két, elegyenként körülbelül 45—46 kiónt tartalmazó csoportot kaptunk, amelyek tetraciklinnel szemben rezisztensek, karbenicillinre pedig érzékenyek voltak; ezeket kiemeltük és külön-külön szaporítottuk őket 37°C hőmérsékleten, éjjelen át, 100 ml oly LB-közegben, amely 10 pg/ml tetraciklint tartalmazott. Ezeket a kultúrákat azután egyesítettük, egy Sorvall GS-3 rotorban percenként 8000 fordulattal 10 percig centrifugáltuk, majd TES pufferoldatta! — 50 mmoj/1 trisz-HC1 (pH=8), 5 mmol/l etiléndiamin-tetraecetsav, 5 mmol/l nátrium-klorid) kétszer mostuk, majd az eredeti kultúra-térfogat 1 literjére számítva 40 ml TES pufferoldatban újból szuszpendáltuk a kultúrát. Az így kapott sejteket lizozim Triton X-100 [vő.: M. Kahn és munkatársai: „Plasmid Cloning Vehicles Derived from Plasmids Col El, F, R6K and RK2", Methods in Enzymology, 68: Recombinant DNA (R. Wu kiadása) 1980 (saj tó alatt)] enzim-készítménnyel lizáltuk. A TES pufferoldattal készített sejt-szuszpenzióból 40 ml-hez 20 ml 50 mmol/l-es trisz-HC1 (pH=8) oldattal készített 10%-os szacharóz-oldatot adtunk, majd 1,3 mg/ml koncentrációig lizozimet adtunk az elegyhez és szobahőmérsékleten 20 percig állni hagytuk. Ehhez a szuszpenzióhoz azután 1 ml 0,5 molos etiléndiamin-tetraecetsav-nátrium-hidroxid oldatot (pH=8), 8 ml 0,2% Triton X-100-at, 25 mmol/l etiléndiamin-tetraecetsavat és 50 mmol/l trisz-HCl-t tartalmazó oldatot (pH==8) adtunk és a lízist teljessététel céljából szobahőmérsékleten még 30 percig folytattuk. A sejt-törmelékeket és a kromoszómás DNS túlnyomó részét egy Beckman SW27 rotorban, percenként 24 000 fordulattal 45 percig folytatott centrifugálással eltávolítottuk. A szupernatáns folyadékot jégben hűtöttük, 1/3 térfogat 40%-os polietilén-glikol 6000 oldatot (2 molos nátrium-klorid oldatban) adtunk hozzá és az elegyet 0°C hőmérsékleten éjjelen át állni hagytuk. A kapott csapa27 dékot egy Sorvall HB4 rotorban percenként 5 000 fordulattal 10 percig centrifugáltuk 4°C hőmérsékleten, majd az így elkülönített csapadékot TES pufferoldatban oldottuk. A kapott oldathoz 0,2 tf. 10 mg/ml koncentrációjú etidium-bromid-oldatot (a Serva cég terméke) adtunk és 1 g/ml koncentrációig cézium-kloridot adtunk hozzá, majd az elegyet egy Beckmann R60 Ti-rotorban percenként 40 000 fordulattal legalább 48 óra hosszat centrifugáltuk; egy poliallomer cső rendszerint elegendő az 1—2 liter eredeti térfogatú kultúrából származó lizátum befogadására. A csőben ibolyántúli besugárzás alatt két DNS-sáv volt látható. A legnagyobb sűrűséget mutató sáv az I DNS-ből származó plazmidnak, a második sáv a II alakú és III alakú plazmid-DNS-eknek és némi kromoszómás DNS- nek felel meg. Az első sávnak megfelelő részt elkülönítettük a csőből, az etidium-bromid eltávolítása céljából izoamilalkohollal hatszor extraháltuk, majd a vizes fázist 0,2 mol/1 nátrium-acetátot tartalmazó víz (pH=5,1 ) háromszoros térfogatával hígítottuk és ezt követően 2,5 tf. etanol hozzáadásával leválasztottuk a DNS-t. Az így kapott DNS-t azután újból oldottuk, fenollal extraháltuk és etanollal újból lecsaptuk. A kapott DNS minőségét elektroforézissel ellenőriztük, 40 mmol/l trisz-ecetsav (pH=7,8), 20 mmol/l nátrium-acetát és 2 mmol/l etiléndiamin-tetraecetsav oldatával készített 1%-os ágár-gélen, etidium-bromidos megfestéssel. Ha a kapott DNS túlságosan sok RNS-sel volt szennyezve, akkor további tisztításnak vetettük alá semleges szacharóz-grádiens centrifugálással: egy 10 mmol/l trisz-HCl-t (pH=7,6), 1 mmol/l etiléndiamin-tetraecetsavat és 1 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó oldatban (36 ml) 5—20%-os szacharóz-grádienst alkalmaztunk és ehhez 300 pg DNS 10 mmol/l trisz-HCl-t (pH=7,6) és 1 mmol etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó pufferoldattal készített oldatát adtuk, majd ezt az elegyet poliallomer csövekben 16 óra hosszat centrifugáltuk 18°C hőmérsékleten egy Beckmann SW27 rotorban, percenként 24 000 fordulattal. A DNS-tartalmú frakciókat (OD260) egyesítettük és nátrium-acetát és etanol hozzáadásával leválasztottuk a DNS-t. „B" lépés: A DNS hibridizálása teljes RNS-sel Körülbelül 150 pg fenti módon előállított DNS-hez kevés 32P-vel egyenletesen jelzett DNS-t és 2 pg pSTNV-1 DNS-t [ez egy rekombináns plazmid, amely a szatellita dohány-nekrózis vírus („STNV”)-RNS teljes méretű cDNS kópiáját tartalmazza, vö.: J. Van Emmelo és munkatársai: „Construction and Characterization of a Plasmid Containing a Nearly Full-Size DNA Copy of Satellite Tobacco Necrosis Virus RNA", J. Mol. Biol (sajtó alatt)] adtunk belső kontrollként, majd az elegyet szonikációnak vetettük alá egy MSE szonikátorban és a terméket nátrium-acetát és etanol hozzáadásával leválasztottuk. 28 19350 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
