193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 mi a-32P-dATP-t tartalmazott. Az elegyet 37°C hőmérsékleten 5 percig inkubáltuk, majd 10 mmol/liter koncentrációig etiléndiamin-teraecetsavat és 0,1% koncentrációig nátrium-dodecil-szulfátot adtunk hozzá, az elegyet fenollal extraháltuk, majd TE-pufferoldatban, Sephadex G50 oszlopon kromatografáltuk. A linearizált és megnyújtott pBR322-t tartalmazó frakciókat 10 mmol/1 trisz-HCl (pH=7,8) pufferoldatban, 0,4 mol/1 nátrium-klorid és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav jelenlétében, oligo(dT)-cellulózon törté-' nő adszorbeáltatás útján tisztítottuk tovább. Alapos mosás után a kívánt frakciókat 10 mmol/trisz-HCl-t (pH=7,8) és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó pufferoldattal eluáltuk. 2. dT-megnyújtású DNS előállítása Kettősszálú DNS-nek dTTMP maradékokkal történő meghosszabítását hasonló módon végeztük, ahogyan azt fentebb a pBR322 dA-meghosszabítására leírtuk, csupán azzal az eltéréssel, hogy a fentiekben szereplő dATP és a-32P-ATP helyett dTTP és némi 3H-dTTP került alkalmazásra. Ebben az esetben természetesen elhagytuk az oligo(dT) -cellulózon történő tisztítást. A fentiekhez hasonlóan a dT-meghosszabítású DNS-különböző fajták elegye, amelyek közül csak igen kevés mutat rokonságot a HuIFN-ß-val (1. ábra). 3. Ca++-.ionokkal kezelt E. coli HB 101 előállítása Ca++-ionokkal kezelt E. coli HB 101 előállítása E. M. Lederberg és S. N. Cohen módszerével [„Transformation of Salmonella Typhimurium by Plasmid Deoxyribonucleic Acid", J. Bacteriol. 119, 1072—1074 (1974)] történt; a E. coli HB101 kultúrát (H. Boyer ajándéka) 5 ml LB-közegbe (literenként 10 rész baktotripton, 5 rész élesztőkivonat és 5 rész nátrium-klorid) oldottuk, majd a kultúrát 37°C hőmérsékleten éjjelen át szaporítottuk. A friss kultúrákat 1:100 arányban hígítottuk 20 ml LB közegben, majd körülbelül 2.10? baktérium/ml sűrűségig szaporítottuk, azután jéggel hirtelen lehűtjük és 4°C hőmérsékleten egy Sorvall SS34 rotorban percenként 6000 fordulattal 5 percig centrifugáltuk. Az így elkülönített sejteket 0°C és 4°C közötti hőmérsékleten tartottuk és 20 ml 100 mmol/1 koncentrációjú kalcium-klorid-oldattal mossuk. A sejteket azután 20 percig jégen tartottuk, majd újból centrifugáltuk, 2 ml 100 mmol/1 koncentrációjú kalcium-klorid-oldatban újból szuszpendáltuk és a szuszpenziót 15 percig 0°C hőmérsékleten tartottuk. 200 pl térfogatú alikvot-részekhez 11% koncentrációig glicerint adtunk; ezt a glicerines elegyet —80°C hőmérsékleten hónapokig lehetett tárolni, anélkül, hogy az aktivitásból veszített volna, [vö.: D. A. Morrison: „Transformation in Escherichia coli: Cryogenic Preservation of Competent Cells", J. Bacteriol. 132, 349— 351 (1977)]. 23 4. A dA-megnyújtású pBR322 és dT-megnyújtású DNS hőkezelése A vektor és DNS-betét komplementer dA- és dT-farok-részeiből hőkezeléssel képezhető az eredetileg kívánt hibrid-plazmid vagy rekombináns DNS-molekula. Ebből a célból a dA-farok-részű Pstl-hasítású pBR322 vektort és a dT-farok-részű cDNS-ek elegyét TSE pufferoldatban — 10 mmol/1 tirsz-HCl (pH= =7,6), 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav, 100 mmol/1 nátrium-klorid — 1,5 pg/ml plazmid-koncentrációban oldottuk, oly módon, hogy a plazmidnak a DNS-betéthez viszonyított mólaránya 1,5 és 2,0 között legyen. Az elegyet 10 percig melegítettük 65°C hőmérsékleten, majd lassan, 4 óra alatt szobahőmérsékletre hűtöttük le. Az így kapott termék természetesen nagyszámú különböző rekombináns DNS-molekula és néhány beiktatott DNS-szekvenciák nélküli klónozás-hordozó elegye. Valamenynyi rekombináns DNS-molekula tartalmaz azonban a PstI helyen egy cDNS szegmenst. Valamennyi ilyen cDNS-szegmens tartalmazhat egy gént vagy annak egy fragmensét. A cDNS fragmensek közül csak igen kevés kódol HuIFN-ß-ra vagy annak egy részére (1. ábra). Túlnyomó többségük más olyan fehérjékre vagy azok részeire kódol, amelyek mRNS-jei a találmány szerinti eljárásban alkalmazott poli(A)RNS részei voltak. Meg kell jegyezni azt is, hogy a fenti módon előállított klón-„könyvtár" kiónjainak esetleg egyike sem engedi meg az IFN-ß immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptidek expresszióját. 5. E. coli HB101 transzfekciója a hőkezelt hibrid plazmidokkal [A transzfekciós eljáráshoz és valamenynyi további oly lépéshez, amelyben a kapott transzformált baktériumokat kezeltük, az USA Nemzeti Egészségügyi Intézet „P3" előírását alkalmaztuk.] A fenti elegyből 90 pl vagy ennél kisebb térfogatú alikvot-részeket alkalmaztunk, ezeket 0°C hőmérsékletre hűtöttük és 1 molos kalcium-klorid oldatot adtunk hozzá 0,1 mol/l koncentrációig. Az így kapott oldatból 100 pl vagy ennél kisebb térfogatú alikvot-részeket 200 pl Ca++-ionokkal kezelt E. coli HB101 jegelt kultúrához adtunk, majd 0°C hőmérsékleten 30 percig állni hagytuk, azután a sejteket hirtelen fölmelegítettük 35°C hőmérsékletre, 5 percig ezen a hőmérsékleten tartottuk, majd 15 perc időtartamra ismét 0°C hőmérsékletre hűtöttük. Ezután 2 ml LB közeget adtunk hozzá, a sejteket rázott vízfürdőben 37°C hőmérsékleten 30—45 percig inkubáltuk, majd a kapott baktérium-szuszpenziót 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó I.B közeggel készített 1,2%-os ágár-lemezekre szélesztettük. Minthogy a pBR322 plazmid a tetracik?in-rezisztencia génjét tartalmazza, az ilyen gént intakt állapotban tartalmazó plazmid-24 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
