193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 sara rekombináns DNS-molekula képzése céljából, a kezdeti klónozásra a találmány értelmében előnyösen oly módszert alkalmazunk, amely szerint a plazmidot (különösen pBR322 plazmidot) a választott beiktatási helyre specifikus resztrikciós enzimmel emésztjük (különösen a PstI helyre specifikus enzimmel), majd dA farok-részeket adunk a 3’-terminusokhoz, terminális transzferáz segítségével. Hasonló módon, a kettősszálú cDNS meghosszabítására dT farok részeket adunk a 3’-terminusokhoz, hogy kapcsolódhassanak a meghosszabított plazmidhoz. A meghosszabított plazmidot és a cDNS-t ezután temperáljuk, hogy beiktassuk a cDNS-t a plazmid megfelelő helyére és hogy cirkularizáljuk a hibrid DNS-t; a farok-részek komplementer jellege megengedi azok kohézióját (vö.: 1. ábra). Az így kapott rekombináns DNS-molekula most már egy beiktatott gént tartalmaz a választott PstI resztrikciós helyen. A beiktatásnak ez a dA-dT farok-képzési módszerét D. A. Jackson és munkatársai: „Biochemical Methods for Inserting New genetic Information into DNA of Simian Virus 40: Circular SV40 DNA Molecules Containing Lambda Phage Genes and the Galactose Operon of Escherichia coli”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69 2904—2909 (1972) és R. Devos és munkatársai fentebb idézett közleménye ismertetik. Ezzel a módszerrel körülbelül háromszor annyi rekombináns DNS-plazmidot kapunk, mint a dG-dC farok-képzési módszerrel. Meg kell jegyezni, hogy a klónozás-hordozó választott helyére beiktatott cDNS-fragmensek vagy nukleotid-szekvenciák sorában lehetnek olyan nukleotidok is, amelyek nem részei a kívánt polipeptidhez való aktuális szerkezeti génnek, vagy pedig amelyek csupán egy fragmensét képezik a kívánt fehérjéhez való teljes szerkezeti génnek. Csupán arra van szükség, hogy bármilyen DNS-szekvencia beiktatása esetén a transzformált gazda olyan polipeptidet termeljen, amely a HuIFN-ß biológiai vagy immunológiai aktivitásával rendelkezik, vagy pedig hogy maga a DNS-szekvencia használható legyen hibridizációs mintaként oly kiónok szelektálására, amelyek a HuIFN-ß immunológiai vagy biológiai aktivitásával rendelkező polipeptidek termelésére felhasználható DNS-szekvenciákat tartalmaznak. Az idegen gént tartalmazó klónozás-hordozót vagy vektort arra alkalmazzuk, hogy a megfelelő gazdát oly módon alakítsa át, hogy az képes legyen olyan, aHuIFN-ß immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptideket exprimálni, amelyeket a hibrid gén kódol. Az e célra megfelelő gazda megválasztása is számos, a szakmában ismert tényezőtől függ. Ilyen tényező például a választott vektorral való kompatibilitás, a hibrid plazmid által kódolt fehérjék toxikussága, a kívánt fehérje kinyerésének egyszerűen vérehajtható volta, az expresszió-jellem-21 12 zők, a biológiai biztonság és a költségek. Ezeket a tényezőket annak figyelembevételével kell egyensúlyba hozni, hogy nem minden szóbajövő gazda lehet egyformán hatásos valamely adott rekombináns DNS-molekula exprimálására. A jelen találmány szerinti szintézisben kezdeti klónozás-hordozóként a pBR322 bakteriális plazmidot alkalmazzuk, előnyös kezdeti resztrikciós endonukleáz-helyként pedig a PstI hely jön tekintetbe (1. ábra). A plazmid egy kisméretű, körülbelül 2,6 megadalton molekulasúlyú plazmid, amely az ampicillin (Amp) és tetraciklin (Tét) antibiotikumokkal szembeni rezisztencia génjeit hordozza. Ezt a plazmidot már teljes mértékben jellemezték korábbi szerzők, mint F. Bolivar és munkatársai: „Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System”, Gene 95—113 (1977); J. G. Sutcliffe: ,,pBR322 Restriction Map Derived from the DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers up to 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids Research 5, 2721—2728 (1978); J. G. Sutcliffe: „Complete Nucleotide Sewuence of the Escherichia coli Plasmid pBR322", Cold Spring Harbor Symposium, 43 I 77—90 (1978). A DNS-terméknek e helyre történő beiktatása útján nagyszámú bakteriális kiónt kapunk, amelyek mindegyike tartalmazza az előzetesen előállított cDNS termékben jelenlevő DNS-gének vagy -fragmensek egyikét. E kiónok közül is csak igen kevés fog tartalmazni az IFN-ß vagy fragmensei létrehozására képes gént (1. ábra) és esetleg egyikük sem fogja lehetővé tenni az IFN-ß immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptidek expresszióját. A jelen találmánnyal kapcsolatban előnyösen E. coli HB 101 alkalmazható kezdeti gazdaként. 1. Pstl-hasított, dA-megnyújtott pBR322 előállítása A pBR322 plazmidot 37°C hőmérsékleten teljesen elemészettük Pstl-endonukleázzal (a New England Biolabs cég terméke) 10 mmol/1 tirsz-HCl (pH=7,6), 7 mmol/1 magnézium-klorid és 7 mmol/1 2-merkapto-etanol tartalmú pufferoldatban. A kapott elegyet 1 tf. fenollal és 10 tf. éterrel extraháltuk, majd a terméket 2,5 tf. etanol és 0,2 molos nátrium-acetát-oldat elegyével leválasztottuk. Homopolimer dA-farok-részek hozzáadását (1. ábra) terminális dezoxinukleotidil-transzferáz (TdT) [L. Chang és F. J. Bollum, „Deoxynucleotide-Polymerizing Enzymes of Calf Thymus Gland”, J. Biol. Chem., 246, 909—916 (1971) módszere szerint tisztítva] segítségével végeztük, 50 pl reakció-térfogatban; a reakcióközeg 0,14 mol/1 kálium-kakodilátot, 30 mmol/1 trisz-HCl-t (pH= =6,8), 1 mmol/1 kobalt-szulfátot, 0,2 pg/pl hőkezeléssel ináktivált bovin szérumalbumint, 0,8 mmol/1 DDT-t, 0,2 mmol/1 dATP-t és né22 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
