193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 Abból a célból, hogy a kettősszálú cDNS-struktúrán megmaradó egyszálú hajtű-hurkot felnyissuk, a lecsapott cDNS-t feloldottuk 100 pl 0,2 mol/1 nátrium-kloridot 50 mmol/1 nátrium-acetátot (pH=4,5), 10 mmol/1 cink-acetátot és 2 pg hővel denaturált borjú-thymus DNS-t tartalmazó oldatban, majd 5 egység Sl-nukleázzal (a Sigma cég gyártmánya) 30 percig reagáltattuk 37°C hőmérsékleten. A reakcióelegyhez 10 mmol/1 koncentrációig etiléndiamint-tetraecetsavat adtunk, fenol, kloroform és izoamilalkohol elegyével extraháltuk, majd a vizes fázisból a terméket 10 pg E. coli transzfer RNS (hordozó), 0,2 mol/1 nátrium-acetát (pH=5,l) és 2,5 tf. etanol hozzáadásával lecsaptuk; ily módon letompított végű kettősszálú cDNS-elegyet kaptunk. Ez az elegy heterogén, ami egyrészt az előállításához templátként alkalmazott poli (A) RNS heterogén voltának (vő.: 1. ábra), másrészt a cDNS transzkriptumoknak az AMV reverz transzkriptáz általi idő előtti lezárásának (ezt az 1. ábra nem mutatja) tulajdonítható. Abból a célból, hogy ennek az utóbbi heterogeneitásnak a hatását csökkentsük, a kettősszálú cDNS-t elektroforézisnek vetettük alá 4%-os poliakrilamid-gélen, 0,5 mmol/1 trisz-borát puffert (pH=4,3) és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldatban; méret-jelzőként 5’-32P-jelzett resztrikciós fragmenseket (0X174 (RF)-DNS) alkalmaztunk. A megfelelő méretű DNS-sávokat (például a 800—900 bp, 700—800 bp, 650—700 bp és 550—650 bp méret-osztályokat) szelektáltuk. Minthogy a poliakrilamid-gélen elektroforizált poli (A) RNS-ből előállított kettősszálú cDNS egy kitűnő sávot mutatott 850 bp körül, ezt a sávot tekintettük a teljes hosszúságú DNS képviselőjének. A sávokat oly módon eluáltuk, hogy a gélt 0,5 mólos ammónium-acetát oldatban 0,1 % nátrium-dodecil-szulfát hozzáadásával szétdörzsöltük és az elegyet éjjelen át kevertük. A törmelékeket centrifugálással eltávolítottuk, majd a DNS-t egy 5 mmol-os nátrium-szulfáttal (pH=7,5) készített Sephadex G50 oszlopra vitt hidroxil-apatit-porra adszorbeáltattuk, a pufferoldattal az oszlopot alaposan mossuk, majd 0,45 mólos nátrium foszfát-oldattal (pH=7,5) eluáltuk és közvetlenül sótlanítottuk a Sephadex G50 matrix szűrő hatása révén. Az eluált DNS-t tartalmazó frakciókat (amelyeket a 32P-rádióaktivitás alapján azonosítottunk) 10 pg E. coli transzfer RNS, nátrium-acetát (0,2 mol/1 koncentrációig) és 2,5 tf. etanol hozzáadásával lecsaptuk. A fent leírt cDNS-előállítási eljárás hatásosságát példaképpen egy olyan tipikus kísérlet mutatja, amelynek során körülbelül 2 pg poli (A) RNS-ből, formamid-szacharóz grádiens alkalmazása után, körülbelül 16 ng kettősszálú cDNS-t kaptunk; e termék mérettartománya 800 bp és 900 bp között volt. Itt is meg kell jegyezni, hogy ez az így kapott kettősszálú cDNS nagyszámú cDNS ele19 gye, amelyek közül csak igen kevés az IFN-ß cDNS (vö.: 1. ábra). Kettősszálú DNS klónozása A találmány szerinti eljárással előállított kettősszálú cDNS klónozására számos különféle gazdasejt/klónozás-hordozó kombináció alkalmazható. Minden egyes specifikus klónozás-hordozón belül különféle helyek választhatók ki a kettősszálú DNS beiktatására. Ezeket a helyeket rendszerint az a resztrikciós endonukleáz jelzi, amelyet a vágásra alkalmazunk, így például a pBR322-ben a PstI hely a ß-laktamáz génjében található, e fehérje 181. és 182 aminosavát kódoló nukleotid triplettek között. Ezt a helyet eredetileg S. Nagata és munkatársai (lásd a fentebb idézett munkájukat) alkalmazták az IFN-ß immunológiai vagy biológiai aktivitását mutató polipeptidek szintézise során. A két Hindii endonukleáz rekogniciós hely egyike a 101. és 102. aminosavat kódoló triplettek között van, a néhány Tag hely egyike a pBR322-ben a ß-laktamäz 45. aminosavát kódoló triplettnél található. Hasonló módon e plazmidban az EcoRI hely és a PvuII hely valamennyi kódolási tartományon kívül fekszik, az EcoRI hely a tetracikün-, illetőleg ampicillin-rezisztenciát kódoló gének között található. Ezt a helyet alkalmazták T. Taniguchi és munkatársai (lásd fentebb idézett munkájukat) rekombináns szintetikus rendszerükben. Ezek a helyek jól smeretesek a szakmabeliek számára. Meg_egyzendő természetesen, hogy a jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazható klónozás-hordozó nem feltétlen rendelkezik egy resztrikciós endonukleáz-hellyel a választott DNS-fragmens beiktatására. Ehelyett a hordozót alternatív módokon is kapcsolhatjuk a fragmenshez. A rekombináns DNS-molekula képzésére választott DNS-fragmens kapcsolására választandó helyet és általában a választandó vektort (klónozás-hordozót) számos különböző tényező határozhatja meg, így például a valamely adott resztrikciós enzim iránt érzékeny helyek száma, az exprimálandó fehérje mérete, a kívánt fehérjének a gazdasejt enzimjei általi proteolitikus lebontással szembeni érzékenysége, az exprimálandó fehérjének a gazdasejt nehezen eltávolítható fehérjével való szennyezettsége vagy azokhoz való kötődése, az expresszió jellemzői, mint például az indító kodonnak és a stop-kodonnak a vektor-szekvenciákhoz viszonyított helyzete és más hasonló, a szakmabeliek által ismert tényező. A vektornak és a beiktatási helynek a megválasztását egy adott gén esetében a fent említett tényezők mérlegelése irányíthatja; egy adott esetben nem mindenfajta választással érhetünk el egyenlően jó eredményt. Bár több különböző módszer ismeretes a szakmában az idegen DNS-nek egy klónozás-hordozóba vagy vektorba való beiktatá-20 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
