193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 1 A találmány dezoxiribonukleinsav (DNS) szekvenciákra, rekombináns DNS molekulákra, valamint emberi fibroblaszt interferon-szerű polipeptidek előállítási eljárására vonatkozik. Közelebbről megjelölve, a találmány alkalmas gazda-szervezetben kialakított DNS szekvenciákra vonatkozik. Az itt leírt rekombináns DNS molekulákat olyan DNS-szekvenciák jellemzik, amelyek oly polipeptideket kódolnak, amelyeknek az aminosav-szekvenciája és aminosav-összetétele lényegileg megegyezik az emberi (humán) fibroblaszt interferonnal és amelyeknek az immunológiai vagy biológiai aktivitása egyezik a humán fibroblaszt interferonéval. Amint az alábbi leírásból kitűnik, a találmány szerinti DNS-szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és előállítási módszerek vírusellenes, tumorellenes, illetőleg karcinomaellenes szerekben é$ gyógyászati eljárásokban felhasználható polipeptidek előállítására alkalmazhatók. E leírásban az interferonokra vonatkozólag a Nature 286, 2421 (1980. július 10.) 110. oldalán ismertetett nomenklatúrát alkalmazzuk a korábbi hasonló tárgyú bejelentéseinkben alkalmazott nomenklatúra helyett, fgy például „interferon” rövidítéseként a korábbi „IF" helyett az „IFN" rövidítést, a fibroblaszt interferon megjelölésére pedig az „IFN-ß” rövidítést használjuk. Az interferonok (IFN) két osztályát ismerjük eddig: az I. osztályba tartozó interferonok kisméretű, savakkal szemben stabil (gliko-)proteinek, amelyek a sejteket ellenállókká teszik vírusos fertőzésekkel szemben [A. Isaacs és J. Lindenmann, „Virus Interference I. The Interferon", Proc. Royal Soc. Ser. B„ 147, 258—267 (1957); W. E. Stewart, II, The Interferon System, Springer-Verlag (1979) (az alábbiakban „The Interferon System")]. A II. osztályba tartozó interferonok savakkal szemben labilisak; közelebbi jellemzésükre ezidő szerint még kevés adat ismeretes. Bár az interferonok bizonyos fokig sejt-specifikusak (The Interferon System, 135— 145. old.), vírusokkal szemben azonban nem specifikusak, hanem a vírusok széles spektrumával szemben védik a sejteket. A humán interferonok („HuIFN") három csoportba sorolhatók, ezeket a, ß illetőleg y humán interferonoknak nevezik. A fibroblaszt interferonnak is nevezett humán ß-interferon („HuINF-ß") a diploid fibroblaszt-sejtekben termelődik, megfelelő indukció hatására. Termelődik továbbá kisebb mennyiségekben, a HuIFN-a nagyobb mennyiségei mellett, a limfoblasztoid sejtekben is. Az ilyen sejtekből termelt ß-interferont már több kutató tisztította és vizsgálta [E. Knight, Jr., „Interferon: Purification and Initial Characterization from Human Diploid Celles", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 73, 520-523 (1976)]. Ez egy 20 000 körüli molekulasúlyú glikoprotein [M. Wiranowska-Stewart és munkatársai: „Contributions of Carbohydrate Moieties to the Phy- 9 2 sical and Biological Properties of Human Leukocyte, Lymphoblastoid and Fibroblast Interferons”, Abst. Ann. Meeting Amer. Soc. Microbiol., 246. old. (1978)]. Ez a termék méret szempontjából heterogén, ami feltehetőleg a szénhidrát-molekularészeknek tulajdonítható. Beszámoltak már az autentikus humán fibroblaszt interferon aminosav-összetételéről is [E. Knight, Jr., és munkatársai: „Human Fibroblast Interferon: Amino Acid Analysis and Amino-Terminal Amino Acid Sequence”, Science, 207, 525—526 (1980) ]. Folyamatban van az autentikus humán fibroblaszt interferon aminosav-szekvenciájának a felderítése is. Ezidőszerint az autentikus érett protein NH2 -terminusa első 13 aminosavának sorrendjét írták le: Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser... (E. Knight, Jr., fentebb idézett műve). Egy közlés szerint a ß-interferont két különálló gén kódolja, az egyik a 2. kromoszómán, a másik az 5. kromoszómán helyezkedik el [D. L. Slate és F. H. Ruddle, „Fibroblast Interferon in Man is Coded by two Loci on Separate Chromosomes", Cell, 16, 171 —180 (1979)]. Más vizsgálatok viszont arra mutatnak, hogy a ß-interferont kódoló gén a 9. kromoszómán helyezkedik el [A. Medger és munkatársai: Involvement of a Gene on Chromosome 9 in Human Fibroblast Interferon Production", Nature, 280, 493—495 (1979)]. Bár az autentikus humán fibroblaszt interferon glikozilezve van, a szénhidrát-molekularész eltávolítása [P. J. Bridgen és munkatársai, „Human Lymphoblastoid Interferon”, J. Biol. Chem., 252, 6585—6587 (1977)], illetőleg a humán fibroblaszt interferonnak a glikozilezést kizáró inhibitorok jelenlétében történő szintézise [W. E. Stewart, II és munkatársai: „Effect of Glycosylation Inhibitors on the Production and Properties of Human Leukocyte Interferon", Virology, 97, 473—476 (1979); J. Fujisawa és munkatársai: „Nonglycosylated Mouse L Cell Interferon Produced by the Action of Tunicamycin", J. Biol. Chem., 253, 8677—8679 (1978); E. Á. Havell és munkatársai: „Altered Molecular Species of Human Interferon Produced in the Presence of Inhibitors of Glycosylation", J. Biol. Chem., 252, 4425—4427 (1977); The Interferon System, 181. old.] útján a humán fibroblaszt interferon olyan kisebb molekulájú alakjához jutotak, amely az interferon-aktivitást még teljes mértékben vagy legalábbis túlnyomó részben megtartja. A humán fibroblaszt interferon, számos más humán fehérjéhez hasonlóan, polimorf is lehet. Ezért bizonyos emberek sejtjei oly fibroblaszt interferon-fajtákat termelhetnek (a humán fibroblaszt interferon általánosabb osztályán belül), amelyek fiziológiailag hasonlók, de szerkezetileg némileg különböznek ennek az interferon-osztálynak a prototípusától. Ezért, bár a humán fibroblaszt interferon fehérje-szerkezete általában jól de-5 IC 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
