193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
et al., Methods in Molecular Biology Vol.7., p. 7., R.B. Wickner Ed., Marcel Dekker Inc., New York, 1974) állítjuk elő. A T4-DNS-polimerázt (5000 egység/ml) a PL-Biochemicals Inc. cégtől (Milwaukee, Wis., USA), a T4- -DNS-ligázt ( 100 egység/ml) pedig a Biolabs cégtől (Beverly, Maryland, USA) szereztük be. Egy következő összetételű reakcióelegyet: 10 pl pBR322 (620 pg/'ml), 10 pl EcoRI-reakciópuffer (300 mM trisz-HCl, 30 mM MgCl2, pH 7,5) és 10 pl hígított EcoRI-oldat 60 percen át 37°C-on inkubálunk és az enzim-reakció leállítására 10 percen át 65°C-on tartjuk. A kvantitatív átalakításhoz szükséges enzim-hígítást előkísérletben határozzuk meg, amelynek során gélelektroforézissel, 0,7% agarózban (J.F. Morow et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 71., 1743—1747., 1974) mérjük a gyürüalakú plazmid-DNS lineárissá való átalakulás mértékét. A (30 pl térfogatú) reakcióelegyhez a következőket adjuk hozzá: 10 pl polimeráz-puffer (600 mM trisz-HCl, 80 mM MgCIj, 100 mM rnerkaptoetanol, pH 7,5), 10 pl 500 mM 2’-dezoxi-adenozin-5’-trifoszfát (d.ATP) -oldat, 10 pl 500 mM 2’-dezoxi-guanozin-5’-trifoszfát (dGTP)-oldat, 10 pl 500 mM 2’-dezoxi-timidin-5’-trifoszfát (dTTP) -oldat, 10 pl 500 mM 2’-dezoxi-citidin-5’-trifoszfát (dCTP) -oldat, 10 pl T4-DNS-polimeráz (1:2000 hígítás) és 10 pl víz. A (100 pl térfogatú) keveréket 30 percen át 37°C-on tartjuk, majd a reakció leállítására 10 percen át 70°C-on tartjuk. Ezután 15 pl ligáz-puffert (660 mM trisz-HCl, 66 mM MgClj, 100 mM ditiotreit, pH 7,6) 15 pl (4 mM) ATP-t, 2 pl T4-DNS-ligázt és 18 pl H2O t adagolunk. A (150 pl térfogatú) keveréket 16 órán át 13°C-on, majd 10 percen át 65°C-on tartjuk. A fennmaradó pBR322-nek a rosszul transzformálható lineáris formában való átalakítására a keveréket a fent leírt módon mégegyszer reagáltatjuk EcoRI-vel (reakciótérfogat 250 pl), majd kétszer extraháljuk 250—250 pl fenollal — amelyet előzetesen DNS pufferrel telítünk — és DNS pufferrel szemben fenolmentesre dializáljuk (végtérfogat: 300 pl). Az E. coli K12 HB101 törzsből (H.W. Boyer, D. Roulland-Dussoix, J. Mól. Bioi. 4L, 459—472., 1969) kompetens sejteket állítunk elő. Kompetens sejtek előállítására Lederberg et al. módosított eljárását alkalmazzuk (J. Bacteriol. 119., 1072—1074., 1974). A sejteket az 1. példa szerint 100 ml L-táptalajban Esoo=0,8 optikai sűrűségig tenyésztjük, centri17 10 fugáljuk és 100 ml (100 mM) MgCl2 oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziót 20 percen át 0°C-on tartjuk, majd centrifugáljuk, a sejteket 50 ml 30 mM töménységű CaCI2 oldatban felvesszük és további 20 percen át 0°C-on való tartás után centrifugáljuk, 5 ml 30 mM töménységű CaCl2 oldatban szuszpendáljuk és további feldolgozásig jégen tartjuk. A transzformációhoz 200 pl, a Ifgázzal végzett átalakítás után kapott DNS oldatot és 400 pl kompetens sejt szuszpenziót összekeverünk, az elegyet 50 másodpercen át 38°C- on, vízfürdőben tartjuk és 60 percen át 0°C-on hagyjuk állni. 8 ml L táptalaj hozzáadása után) 10 g/l tripton (Difco), 5 g/l élesztőkivonat, 5 g/l NaCl; E.S. Lennox, Virology 1., 190—206., 1955) a sejteket 2 órán át 37°C-on inkubáljuk, majd 100 ml, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L táptalajba visszük át és további 16 órán át 37°C-on inkubáljuk. Ennek az ampicillines dúsításnak a termékéből a szokásos módon agar-lemezeken olyan különálló telepeket különítünk el, amelyek 100 pg/ /ml ampicillinnel és 25 pg/ml tetraciklinnel szemben rezisztensek. 4 különálló telepből ismert eljárások szerint (G.O. Humphreys et ah, Biochem.Biophys.Acta 383., 457—463., 1975) izoláljuk a plazmid-DNS-t. Mind a 4 esetben olyan plazmidot kapunk, amely a kiindulási pBR322 plazmidtól csak az EcoRI reakció-szekvencia hiánya tekintetében különbó'zik. Ezt a plazmidot a pSB18 jellel látjuk eh b.) A pSB53 plazmid előállítása A HindlII restrikciós endonukleáz elkülönítését ismert eljárások szerint (H.O. Smith, K.W. Wilcox, J. Moh Bioi. 51., 379—391., 1970 és P. Philippsen, R.E. Streek, H.G. Zachau, Eur.J.Biochem. 45., 479—488-., 1974) végezzük. A BamHI restrikciós endonukleázt a Biolabs cégtől szerezzük be. Egy reakcióelegyet, amely a következő őszszetételű* 2 pl pSB18 (350 pg/ml) 8 pl pSB47 (40 pg/ml) 10 pl HindlII reakciópuffer (20 mM trisz-HC1, 20 mM rnerkaptoetanol, 20 mM MgCl2, 180 mM NaCl, pH 7,4) 5 pl hígított HindlII oldat és 5pl BamHI oldat 60 percen át 37°C-on és 10 percen át 65°C-on tartunk. A kvantitatív hasításhoz szükséges enzim-hígítást előzetesen az 1. példa szerinti eljáráshoz hasonlóan, gélelektroforézissel határozzuk meg. A keverékhez hozzáadunk 10 pl ligáz puffert, 10 pl ATP-t (4 mM), 1 pl T4 ligázt és 50 pl H2Ó-t. Ezután az elegyet 16 órán át 13°C- on inkubáljuk, kétszer extraháljuk fenollal és DNS pufferrel szemben dializáljuk. A foszfatáz-negatív SB44 mutánsnak a DNS oldattal való transzformációját és az ampicillin-rezisztens, foszfatáz-pozitív telepek szelektálását a 2b. példa szerint végezzük. 18 193504 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
