193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
193504 Néhány ilyen telepből elkülöníthető egy 8600Bp molekulasúlyú, pSB53 jelű plazmid, amely Hind 111 és BamHI restrikciós endonukleázzal végzett egyidejű hasítással 2, 4020Bp és 4600Bp molekulasúlyú fragmentümra bontható. A nagyobb fragmentum gél - elektroforézíssel végzett elemzés alapján azonosnak bizonyul egy olyan fragmentummal, amely a pSB47 és a pSB18 Hindlll-mal és BamHI-gyel végzett elbontása során egyaránt keletkezik és amelyről ezért feltehető, hogy az alkálikus foszfatáz gént hordozza. A pSB53- -ból kapott második fragmentum (4020Bp) azonos a pSB18-ból kettős elbontással előállított nagyobb fragmentummal. 5. példa A pSB53 tulajdonságai A restrikciós térkép előállítására a pSB53- ból kapott plazmidot az EcoRI, Hind 111. BamHI, PstI, Sáli, BglII, Kpnl, Xhol és Xbal restrikciós endonukleázzal reagáltatjuk. Az EcoRI-t, HindIII-t és BamHI-t ugyanabból a tételből vesszük, amelyet az 1. példában használtunk; a többi enzimet a Biolabs cégtől szerezzük be. A standard reakcióelegy 10 pl pSB53-t (170 pg/ml), 10 pl reakciópuffert és 10 pl enzim-hígítást tartalmaz. A reakcióhoz a 4. példa szerinti ill. az enzim előállítója által megadott puffereket alkalmazzuk. A kombinált átalakításhoz szükséges enzimhígításokat előkísérletben határozzuk meg, a lambda bakteriofág DNS-ének hasításával. A reakcióelegyet 60 percen át 37°C-on és 10 pl leállító oldat hozzáadása után további 30 percen át 37°C-on inkubáljuk. A leállító oldat 100 mM EDTA-t, 400 mg/ml szacharózt és 0,5 mg/ml proteináz K-t (Merck, Darmstadt) tartalmaz. A reakcióelegyet 0,7% agarózt (J.F Morrow et al., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 71., 1743—1747., 1974 (vagy 3,5% poliakrilamidot) T. Maniatis et al., Biochemistry 14., 3787—3794., 1975) tartalmazó gél-lemezen elektroforézíssel elemezzük. A DNS-fragmem tumok molekulasúlyának meghatározását olyan, kalibrációs célokra használható fragmentumokkal való összehasonlítás útján határozzuk meg, amelyeket J. G. Sutcliffe szerint (Nucl. Acid Res. " 5., 2721—2728., 1978) pBR322-ből állíthatunk elő. A HindlII, BamHI, Sáli és Xhoí enzim mindig ugyanazt a molekulasúlyú lineáris sávot szolgáltatja, míg az EcoRI és a PstI hatására 2 ill. 3 kisebb sáv keletkezik. A BglII, Kpnl és az Xbaf nem bontja el a pSB53-t. A 4b. példa szerint, a Hindlll-mal és BamHI-gyel végzett egyidejű hasítással kapott sávok közül a 4020Bp molekulasúlyú a pBR322-ből ismert PstI és Sáli hasítási helyeket tartalmazza, míg az E. coli K12 kromoszóma-SDNS-éből származó 4600Bp molekulasúlyú sávot az Xhol 2 fragmentumra (ezek molekulasúlya: 2580Bp és 2020Bp) bontja. A 2580Bp molekulasúlyú fragmentumot az EcoRI 3 szubfragmentumra (ezek molekulasúlya: 1210, 1040 és 330Bp) bontja, míg a 19 2020Bp molekulasúlyú fragmentum Pstl-gyel 3 szubfragmentumra (molekulasúlyuk: 820, 740 és 460Bp) bontható. Ezekből az adatokból, valamint további, HindlII/EcoRI-gyel, valamint BamHI/Pstl-gyel végzett összehasonlító kettős átalakítások alapján vezethető le a pSB53-ra az 1. ábrán bemutatott restrikciós térkép. A phoA génnek ß pSB53 EcoRI-hasítási helye tartományában való kimutatására a 330Bp molekulasúlyú EcoRI fragmentumot egy másik, 3600Bp molekulasúlyú EcoRI-fragmentummal cseréljük ki, amely az E. coli K12 phoA génjét hordozza. Ez a fragmentum a pSB37 plazmidból állítható elő, amelyben a pBR313-mal alkotott hibrid plazmidként fordul elő (F. Bolivar et al.. Gene 2., 75—93., 1977). A pSB37 felvétele következtében az Ë. coli K12 HBIOI prolin-deficiens törzs és az ebből levezetett foszfatáz-negatív E. coli SB44 mutáns prolin-prototróf, valamint ampicillines tetraciklin-rezisztens, míg a pSB53 csak ampicillin-rezisztenciát vált ki. Egy keveréket, amely 5 pl pSB53-t (170 pg/ml), 5 pl pSB37-t (90 pg/ml), 10 pl reakciópuffert és 10 pl EcoRI-oldatot tartalmaz, a 4a. példa szerint reagáltatunk és a reakciót melegítéssel állítjuk le. A DNS-keverék T4 ligázzal való további átalakítását, az E. coli SB44 törzs transzformációját és az ampicillin-rezisztens sejtek dúsítását a 4b. példa szerint végezzük. Az ezen tenyészet 2 ml-ében jelenlevő sejteket centrifugálással elkülönítjük, 2 ml steril NaCI oldatban (9 g/1) szuszpendáljuk, NaCI oldattal hígítjuk, különböző hígítási lépcsőkben prolint nem tartalmazó minimális agar táptalajra szélesztjük — amelynek összetétele: 1.0 g/1 NH4C1 0,25 g/1 MgS04-7H20 3.0 g/1 KH2P04 7.0 g/1 Na2HP04-2H20 4 0 g/1 glukóz 0,5 g/1 NaCI 20 mg/1 leucin 1 mg/l B, vitamin pH 7,0 (M9 táptalaj) — és 37°C-on egyes telepek megjelenéséig tenyésztjük. A tetraciklin-érzékeny telepeket bélyegző-technika segítségével 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó agar-lemezekre való átvitellel azonosítjuk. Megvizsgáljuk a telepek lúgos foszfatáz képzési képességét és azt tapasztaljuk, hogy minden ilyen telep foszfatáznegatív. A plazmid-DNS-t, amelyet a Pro+,Pho~, Ap+,Tc~ fenotípusú telepekből izolálunk és amelyet a pSB54 jelzéssel látunk el, az előbbiek szerint EcoRI-gyel hasítjuk és gélelektroforézissel elemezzük. 2, 8290Bp és 3600Bp molekulasúlyú DNS-sáv mutatható ki, amelyek azonosak a pSB53-ból és a pSB37-ből származó megfelelő sávokkal. A pSB53-ban jelenlevő 330Bp molekulasúlyú fragmentum azonban a pSB54-ben már nem található meg. 20 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
