193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
193504 16 záadása után a sejteket 2 órán át 37°C-on inkubáljuk, majd 100 ml, 50 fxg/ml ampicil 1 int tartalmazó L táptalajba visszük át és további 16 órán át 37°C-on inkubáljuk. Ennek az ampicillines dúsításnak a reakcióelegyéből ugyanazzal a módszerrel különítünk el egyes foszfatáz-pozítív telepeket, mint amelyet az 1. példában a foszfatáz-negatív mutánsok izolálására alkalmaztunk. Kb. 10000 színtelen telep között mindig volt egy sárga. c.) A pSB47 plazmid elkülönítése és jellemzése A sárga telepek közül ismert eljárások szerint (G. O. Humphreys et al., Biochem. Biophys.Acta 383., 457—463., 1975) elkülönítünk egy 16,8 milliárd molekulasúlyú plazmidot, amelyet a pSB47 jelzéssel látunk el és amely BamHI-vel végzett hasítás után agaróz gélben 2 DNS sávot mutat, ezek: egy 5,8 milliárd molekulasúlyú termék (lineáris pBR313) és egy 1 1 milliárd molekulasúlyú termék (kromoszóma-pho fragmentum). Az 1. példában felsorolt mutánsok transzformációjával kimutattuk, hogy a pSB47 plazmid egy phoA gént tartalmaz. 3. példa A pSB51 plazmid előállítása Az irodalomban ismertetett eljárások szerint (G.O. Humphreys et al., Biochem. Biophys. Acta 383., 457—463., 1975) izoláljuk a pWB2 vektor-plazmidot, amely egy, a Hind 111 restrikciós endonukleáz által megtámadható hasítási hellyel rendelkezik és az a m p ici 11 in nel és a kolicin El-gyei szembeni rezisztenciát közvetíti (W. Biodol et al., Molec.Gen.Genet. 152., 231—237., 1977). Az eljárás annyiban különbözik a 2. példában leírttól, hogy az E. coli DNS helyett 45 pl (135 pg/rnl) S. marcescens vad típusból származó kromoszóma-DNS-t alkalmazunk és a pWB2 vektort, valamint a S. marcescens DNS-t a Hindin restrikciós endonukleáZzal hasítjuk. Egy reakcióelegyet, amely 15 pl pWB2-t (360 pg/ml DNS) 45 pl kromoszóma-DNS-t (135 pg/ml) 60 pl HindlII reakciópuffert (20 mM trisz-HC1, 20 mM merkapto-etanol, 20 mM MgClj, 180 mM NaCl, pH 7,4) és 60 pl hígított HindlII oldatot tartalmaz, a 2. példa szerint 60 percen át 37°C-on inkubáljuk és az enzim-reakció leállítására 10 percen át 65°C-on tartjuk. A további reakciókat a 2. példa szerint végezzük. A 2. példa szerint elkülönített foszfatáz-pozitív telepekből izolálható egy 9,6 milliárd molekulasúlyú, pSB51 jelzésű plazmid, amelyben HindlII-mal való reagáltatás után gélelektroforézissel 2 DNS sáv mutatható ki, mégpedig egy 7,1 milliárd molekulasúlyú (lineáris pWB2) és egy 2,5 milliárd molekulasúlyú (kromoszóma-fragment um). Az 1. példa szerint végzett transzformációval kimutatható, hogy a pSBBl csak 1 phoA gént tartalmaz. 15 Az E. coli SB44 által előállított lúgos foszfatázt korongelektroforézissel összehasonlítjuk az E. coli K12 és a S. marcescens megfelelő enzimeivel. Ennek érdekében a nyers enzimeket ozmotikus sokkal izoláljuk az indukált sejtekből (A. Torriani, Procedures in Nucleic Acid Research, p. 224—235., G.L. Cantoni és D.R. Davies, Ed. Harper és Row, Publ., New York, 1966). Közelebbről: 0,5 1, a táblázat szerint előállított rázott tenyészetből centrifugálással elkülönítjük a (kb. 1,5 g nedves súlyú) sejt - -tömeget, háromszor mossuk 10 mM pH 7,7 trisz-HCI pufferrel és 30 ml szacharóz-oldatban (0,5 M szacharóz, 30 mM trisz-HCI, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 10 percen át szobahőmérsékleten kevertetjük. A sejteket centrifugáljuk, 30 ml 3—5°C hőmérsékletű vízben szuszpendáljuk, 10 percen át kevertetjük és ismét centrifugáljuk. A felüItiszóbó 1 ammóniumszulfáttal való 85%-os telítés mellett kicsapjuk a nyers enzimet, a fehérje-csapadékot 0,6 ml pH 8,5 37 mM trisz-HCI pufferben oldjuk és ugyanezzel a pufferrel szemben dializáljuk. A nyers foszfatázok korong-elektroforéziséhez (H.R. Maurer, Disk-EIektrophorese, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, 1968) 10%os elválasztógélből — 0,185 M pH 8,5 trisz-HCl-ban — és 5%-os gyűjtőgélből — 0,037 mM pH 8,5 trisz-HCl-ban — álló akrilamid gél lemezeket alkalmazunk és az elektroforézishez pufferként 0,037M pH 8,5 trisz-borát oldatot veszünk. Az elválasztást 450 V feszültség mellett (4 órán át) végezzük. A gélben a foszfatáz-sávokat jellegzetes színreakcióval mutatjuk ki (O. Gabriel, Methods in Enzymology Vol. 22., p. 590., W.B. Jakoby Ed., Academie Press, 1971.), amely az alfa-nafto-1-foszfát alfa-naftollá való hidrolízisén és egy azofesték képződésén alapul. A két vonatkozási törzsből származó enzim-preparátumok az ismert képet mutatják: ez 3 szorosan egymás mellett elhelyezkedő foszfatáz sávból áll, amelyek egyértelműen megkülönböztethetők (a S. marcescens enzim sávjai észrevehetően lassabban futnak, mint az E . coli K12 enziméi). Az E. coli SB44 (pSB51 ) -bői származó enzim a S.marcescens enzimével egyező sáv-képet mutat (1. a 2. ábrát). 4. példa A pSB53 plazmid előállítása a.) A pSB18 enzim előállítása A pSBI8-at a pBR322 plazmidból állítjuk elő az EcoRI restrikciós szekvencia eltávolításával. A pBR322-t már leírták (Bolivar et al., Gene 2., 95—113. 1977); az e közleményben megadott módon végezzük az elkülönítést. A DNS-t DNS-pufferben (45 mM trisz- HCI, 0,1 mM EDTA, pH 7,9) oldjuk és ebben a formában használjuk fel. Az EcoRI restrikciós endonukleázt az irodalomból ismert eljárások szerint (P.J. Greene 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
