193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
193504 5 g/l töménységű l-nitrozo-3-nitro-l-metil-guanidin (NMG) oldatból kaptunk — olymódon, hogy 0 (kontroll), 10, 25, 50 és 100 pg/ml koncentrációt alakítsunk ki. A mintákat 10 percen át 37°C-on inkubáljuk, ezt követően azonnal centrifugáljuk -|-40C-on, az alsó fázist kétszer mossuk 5—5 ml hideg steril NaCl oldattal (9 g/l) és 5—5 ml NaCl oldatban újra szuszpendáljuk. A hígítási sor agar-lemezekre (1,5% agart tartalmazó L táptalaj) való szélesztésével meghatározzuk az élő sejtek számát. A NMG-t nem tartalmazó kontroll minta értékével való összehasonlítás arra mutat, hogy a 10 pg/ml NMG-t tartalmazó mutációs elegy a mutánsok szelektálása szempontjából különösen kedvező 0,5%-os túlélési arányt biztosítja. Ennek az elegynek egy hígításából, amely kb. 1000/ml sejtet tartalmaz, 0,1 ml-es mintákat viszünk át 0,15% agart tartalmazó olyan LP táptalajból (K. Kreuzer et al., Genetics 81., 459—468., 1975) álló agar lemezekre, amelyhez 20 mg/1 L-prolint és 20 mg/ml L-leucint adagoltunk. Ebben a táptalajban a lúgos foszfatáz szintézise az alacsony foszfát-tartalom következtében már nem gátolt. 48 órán át 37°C-on való tenyésztés után azokra a lemezekre, amelyeken egyedülálló telepek találhatók, IM trisz-HCl pufferben 5 mg/ml p-nitrofenil-foszfátot tartalmazó (pH 8,0) oldatot rétegezőnk. Azokat az egyes telepeket, amelyek néhány percen belül nem mutatnak sárga elszíneződést, átoltjuk és a táblázatban leírt módon tovább vizsgáljuk, a lúgos foszfatáz képzés kvantitatív meghatározásával. 2 foszíatáz-negatív mutánst találunk, amelyeket E. coli SB43-nak és SB44-nek nevezünk. Mint a 3. példában kimutatjuk, a pSB51 plazmid az E. coli SB44 mutánsban a S. marcescens lúgos foszfatázának képződését idézi elő. Ennélfogva a pSB51 plazmidnak egyrészt egy S. marcescens phoA gént kell tartalmaznia, és az E. coli SB44 mutánsnak phoA mutánsnak kell lennie. Mivel az SB43 mutáns a pSB51-gyel való transzformáció után nem lesz foszfatáz-pozftív, ennek phoB mutánsnak kell lennie. Ezt a rendszerezést megerősíti a hiteles phoA és phoB mutánsoknak a következő példákban leírt plazmidokkal végzett transzformációja. 2. példa a.) A pSB47 plazmid előállítása Vektorként a pBR313 plazmidot alkalmazzuk, amely rezisztenciát vált ki ampicillinnel és tetraciklinnel szemben (F. Bolivar et al., Gene 2., 75—93., 1977). A pBR313 plazmidot az ott leírt módszer szerint izoláljuk (ATCC 40014). A nagymolekulájú kromoszóma-DNS-t az E. coli K12 vad típusú baktériumokból Saito et al. fenol-extrakciós eljárása szerint (Biochem. Biophys. Acta 72., 619—629., 1963), de az RNÁzzal való lebontás mellőzésével különítjük el. Mindkét DNS-t DNS-pufferrel szemben (46 mM trisz-HCl, 13 8 0,1 mM EDTA, pH 7,9) dializáljuk és ilyen formában használjuk fel a továbbiakban. A BamHl-t és a T4 ligázt (1000 egység/ml) a Biolabs cégtől (Beverly, Maryland, USA) szereztük be. A plazmidot és a kromoszóma-DNS-t a BamHI restrikciós endonukleázzal Biolabs, 4000 egység/ml) reagáltatjuk. A BamHl-t tartalmazó reakcióelegy a következő összetételű: 15 pl pBR313 (250 pg/ml DNS) 45 pl kromoszóma-DNS E. coli K12-ből (180 pg/ml) 60 pl BamHI reakció-puffer (20 mM trisz-HC1, 60 mM KC1, 20 mM MgCl2, 20 mM ditioeritrit, pH 7,5) 60 pl BamHI (1:40 hígítás). Az elegyet 60 percen át 37°C-on inkubáljuk és az enzim-reakció leállítására 10 percen át 65°C-on tartjuk. A kvantitatív átalakításhoz szükséges enzim-hígítást előkísér leiben határoztuk meg, amelynek során a gyűrűalakú plazmid lineárissá való átalakulásának mértékét 0,7% agarózban végzett gél - elektroforézissel mértük (J.F. Morrow et al., Proc.Natl.Acad.Sei.USA 71., 1743—1747., 1974). Az előbbi reakcióelegyhez (180 pl) 40 pl T4 ligáz-puffert: 660 mM trisz-HCl, 66 mM MgCI2, 100 mM ditioeritrit, pH 7,6, valamint 40 pl ATP-t (4 mM), 2 pl T4 ligázt és 138 pl H2Ó-t adagolunk (az össztérfogat 400 pl). A keveréket 16 órán át 13°C-on inkubáljuk, kétszer extraháljuk 400—400 pl fenollal — amelyet előzetesen TES pufferrel (50 mM trisz-HC1, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,0) telítettünk — és DNS pufferrel szemben fenol-mentesre dializáljuk. b.) pho+ sejtek transzformációja és szelekciója A ligázzal végzett átalakítással az E. coli SB44 phoA mutánsa kompetens sejtjeit transzformáljuk (1. az 1. példát). Kompetens sejtek előállítására Lederberg et al. (J. Bacteriol. 119., 1072—1074., 1974) módosított eljárását alkalmazzuk. A sejteket az 1. példa szerint 100 ml L táptalajban E5oo=0,8 optikai sűrűségig tenyésztjük, centrifugáljuk és 100 ml MgCl2 oldatban (100 mM) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 20 percen át 0°C-on tartjuk, majd centrifugáljuk, a sejteket 50 ml 30 mM töménységű CaCl2 oldatban felvesszük és további 20 percen át 0°C-on való tartás után centrifugáljuk, 5 ml 30 mM töménységű CaCI2 oldatban szuszpendáljuk és további feldolgozásig jégen tartjuk. A transzformációhoz (W. Goebel, R. Bonewald, J. Bacteriol. 123., 658—665., 1975) 200 pl jéghideg ligáz-reakcióterméket és 400pl kompetens sejt szuszpenziót összekeverünk, az elegyet 50 másodpercjen át 38°C hőmérsékletű vízfürdőben tartjuk es 60 percen át 0°C-on hagyjuk állni. 8 ml L táptalaj hoz14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
