193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására

193504

Egy másik vektor, amely ugyanolyan fúziós fehérjék előállítását teszi lehetővé, mint a pSB53 plazmid, a pSB86 plazmid (1/a ábra), amely még a phoA gén amino-terminális részét is tartalmazza. Ugyanilyen célból alkalmazhatók azok a plazmidok is, amelyek a pSB53 plazmidnak már csak az (1040Bp molekulasúlyú) EcoRI/HindlII fragmentumát tartalmazzák. A pSB53 vagy a pSB47 plazmidból további Pst-fragmentumokat állíthatnánk elő — amelyek a teljes phoA gént tartalmazzák — és használhatnánk fel új vektorok összeállítására, hogy a számos kombinációs lehetőség közül csak egyet említsünk. További restrikciós endonukleázok vizsgálata révén valószínűleg további kapcsolódási helyeket találhatnánk a lúgos foszfatáz gén rész-szekvenciájával rendelkező fúziós gének előállítására.

Hibrid gének és fúziós fehérjék előállítására szolgáló vektorok (expressziós vektorok) összeállítására további lehetőségeket íiyújt a restrikciós szekvenciáknak a lúgos foszfatáz génbe való utólagos bevitele. Már leírtak különböző eljárásokat, amelyek ezt lehetővé teszik. így pl. EcoRI szekvenciák képződését váltották ki egy fág-vektorban metilezés után végzett in vitro mutációval (B. Gronenborn, I. Messing, Nature 272., 375—377., 1978).

Sokkal szélesebb körben alkalmazható egy másik eljárás (F. Heffron, M. So, . B.I. McCarthy, Proc.Natl.Acad.Sei.USA 75., p. 6012—6016., 1978), amelynek során egy, a kívánt restrikciós szekvenciát tartalmazó szintetikus oligonukleotidot bevezetünk egy, a plazmid vektoron található génbe. Ezután a vektor-DNS-t egy megfelelő endonukleázzal, amely a gyűrűalakú kétágú DNS-t sok különböző helyen tudja hasítani, a nem teljes hasításnak megfelelő körülmények között reagáltatjuk, úgy, hogy zömmel teljes hosszúságú lineáris molekulák keletkezzenek. Ezeket egy megfelelő eljárással, pl. preparatív gélelektroforézissel elválasztjuk a többi reakcióterméktől és az esetleg jelenlevő egyágú láncokat DNS-polimeráz segítségével átalakítjuk teljes kétágú molekulákká. A DNS végeire T4 ligázzal felvisszük a szintetikus restrikciós szekvenciát. Komplementer egyágú láncok előállítására a megfelelő restrikciós endonukleázzal végzett hasítás után a gyűrű zárására ismét DNS ligázzal reagáltatunk. Ennek során olyan gyűrűs molekulák keletkeznek, amelyek a szintetikus restrikciós szekvenciát mindazokon a helyeken tartalmazhatják, amelyeken az endonukleázzal korábban hasítást végeztünk. Megfelelő gazdasejt — ebben az esetben az E. coli SB44 phoA mutánsa — transzformációja, és az olyan transzformánsok szelekciója után, amelyek nem váltak pozitívvá a szóbanforgó gén vonatkozásában) azaz a jelen esetben pho~ jellegűek maradtak) olyan sejtklónokat kapunk, amelyekből olyan plazmidok különíthetők el.

11

amelyek a szintetikus restrikciós szekvenciát különböző meghatározott helyeken beépítették a plazmid génbe (itt. a phoA génbe).

Heffron és társai a részleges hasításhoz hasnyálmirigy-dezoxiribonukleázt alkalmaztak. Ugyanígy alkalmazhatunk restrikciós endonukleázokat is, amelyek igen gyakran és ezért nagy valószínűséggel az átalakítandó génben végeznek hasítást. Mindenekelőtt ilyenek azok a restrikciós endonukleázok, amelyek 4 bázispár-szekvenciát ismernek fel. Ezek gyakran azzal a további előnnyel rendelkeznek a hasnyálmirigy-DNÁzzal szemben, hogy közvetlenül teljes kétágú molekulákat szolgáltatnak. Az ismert restrikciós endonukleázokra vonatkozóan egy új összefoglaló munka áll rendelkezésre (R.I. Roberts, Methods in Enzymology, Vol. 68., p. 27.; Colowick és Kaplan Ed., Academie Press, New York, 1979.).

1979. július 16-án a következő plazmidokat és plazmid-tartalmú baktériumtörzseket helyeztünk letétbe az American Type Culture Collection-ben (ATCC, Rockville, Md., USA), az itt megadott letétbehelyezési számok alatt: pWB2 plazmid (ATCC 40013) pBR313 ” (ATCC 40014)

pBR322 " (ATCC 40015)

pSB18 " (ATCC 40016)

pSB47 " (ATCC 40017)

pSB50 " (ATCC 40018)

pSB51 " (ATCC 40019)

pSB53 " (ATCC 40020)

pSB87 " (ATCC 40021) és

E. coli SB44 pSB47 plazmiddal (ATCC 31540)

” " pSB51 ” (ATCC 31541)

" " pSB53 " (ATCC 31542)

S. marcescens vad típus, pSB51 plazmiddal (ATCC 31543).

Ezenkívül 1979. július 16-án a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen-nél (DSM, Göttingen, NSZK) a következő mikroorganizmusokat helyeztük letétbe, az itt megadott letétbehelyezési számok alatt:

E. coli SB44 (DSM 1606)

E. coli HB101 (DSM 1607)

S. marcescens vad típus (DSM 1608). Az E. coli KI2 vadtípus letétbehelyezése már 1973. november 26-án megtörtént (DSM 408).

1. példa

Az E. coli SB44 phoA mutáns elkülönítése 25 ml L táptalajt, amely 10 g/1 triptont (Difco), 5 g/l élesztőkivonatot és 5 g/1 NaCl-t tartalmaz (E.S. Lennox, Virology 1., 190—

206., 1955), beoltunk 0,25 ml tenyészettel, amelyet úgy állítottunk elő, hogy E. coli K12 HBlOl-t L táptalajban egy éjszakán át tenyésztettünk (H.W. Boyer, D. Roulland-Dussoix, J. Mól. Bioi. 4L, 459—472., 1969), és a tenyészetet 37°C-on szabályozható hőmérsékletű rázógépen rázatjuk. Az exponenciális növekedési fázis elérésekor (E500 kb. 1,5) a tenyészetből 5 ml-es mintákat veszünk és mindegyikhez hozzáadunk 0,1 ml megfelelő h'gítású oldatot — amelyet frissen készített,

12

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65