193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
193504 foszfatáz gén nukleotid-szekvenciája, másrészt a beépült idegen DNS nukleotid-szekvenciája határozza meg. Ezért ezeknek a vektoroknak az alkalmazása továbbfejlesztést jelent a fent idézett eljárásokhoz képest az eukarióta peptidek és fehérjék mikrobiológiai szintézise területén. A lúgos foszfatázok mint fúziós partnerek az eukarióta gének kifejlesztése során egyesítik magukban a beta-galaktozidázok és a beta-laktamázok előnyeit. Mint a beta-galaktozidázok, megfelelő táptalaj-összetétellel (alacsony foszfát-koncentráció) nagymértékben indukálhatok és a beta-laktamázokhoz hasonlóan a sejtmembránon keresztül kikerülnek a periplazmatikus térbe (1. T.W. Reid és I.B. Wilson összefoglalóját: The Enzymes, Ed. P.D. Boyer, Acad. Press, 1971., Vol. IV., p. 373—415.). Annak érdekében, hogy a foszfatáz-vektorok a fent leírt módon alkalmazhatók legyenek fúziós fehérjék előállítására, ezeket úgy kell felépíteni, hogy a restrikciós szekvencia, amelybe a kifejlesztendő idegen DNS-t be kell juttatni, a foszfatáz génen kívül a vektor fennmaradó részében lehetőleg ne forduljon elő mégegyszer, A 4. és a), példában leírt pSB53 és pSB87 plazmid teljesíti ezeket a feltételeket. Már kimutatták, hogy az E. coli lúgos foszfatáz génje a pSB47 plazmidban egy 4600Bp molekulasúlyú DNS-fragmentumon fordul elő (Bp=bázispár), amely a BamHI és a Hindii! restrikciós endonukleázokkal végzett egyidejű hasítás során szabadítható fel. Ezt a fragmentumot DNS ligázzal végzett reakcióban a pSB18 plazmidhoz kapcsoltuk, amely a pBR322-ből az EcoRI szekvencia eltávolításával volt előállítható és amely rezisztenciát vált ki ampicillinnel és tetraciklinnel szemben. A pSB18-at a ligázzal való reagáltatás előtt ugyancsak HindlII-mal és BamHI-vel kezeltük: ennek során egy kis rész-fragmentum távolítható el, amely részben felelős a tetraciklin-rezisztenciáért. A foszfatáz-negatív SB44 mutánsnak a DNS keverékkel végzett transzformálása után ampicillin-rezisztens, tetraciklinre érzékeny és foszfatáz-pozitív sejteket különítettünk el. Ezekből volt izolálható a pSB53 plazmid. Az ebben található phoA fragmentum közvetlenül is előállítható E. coli K12-ből származó kromoszóma-DNS- ből, HindlII-mal és BamHI-vel végzett hasítással. A pSB53 és a többi vektor előállításának fontos előfeltétele a foszfatáz-negatív E..coli SB44 mutáns alkalmazása. A pSB53 restrikciós térképét — a Hind 111, BamHI, EcoRI, PstI, Xhol és Sáli enzim vonatkozásában — az 1. ábrán mutatjuk be. Kimutatható volt, hogy ha a pSB53-ban a 330Bp molekulasúlyű EcoRI fragmentumot egy másik EcoRI fragmentumra cseréljük ki, a lúgos foszfatáz gén inaktiválódik. Ennek a génnek tehát az EcoRI restrikciós szekvencia tartományában kell elhelyezkednie. A pSB53 részleges elbontásával két fragmentumot kaptunk — ezek molekulasúlya 2157Bp és 9 2360Bp —, amelyek közül az egyik (2157Bp) az 1. ábrán bemutatott 787, 1040 és 330Bp molekulasúlyú szekvenciákat foglalja magában, míg a másik (2360Bp) a 330, 1210 és 820Bp molekulasúlyú szekvenciákból áll. Ezt a két fragmentumot pBR322 segítségével E. coli SB44-ben klónoztuk; ennek eredményeként az la illetve lb ábrán bemutatott pSB86 és pSB87 plazmidot kaptuk. Egyik plazmid sem rendelkezik ép lúgos foszfatáz génnel, amiből az következik, hogy mindkét, a pSB53- -ban jelenlevő EcoRI restrukciós szekvencia ebben a génben helyezkedik el. A pSB53-ban előforduló PstI szekvenciák a phoA génen kívül vannak jelen. Kimutatták, hogy a foszfatáz-képződésnek a közeg foszfát-koncentrációja által való befolyásolása pozitív, ellenőrzött folyamat, és hogy a phoA gén transzkripciójához egy aktivátorra van szükség, amely ennek a génnek egy promotor szakaszához kötődik. Az aktivátor egyik lényeges alkotóeleme a phoB gén terméke (H. Morris et al., J. Bacteriol. 119., 583—592., 1974; C. Pratt és A. Torriani, Genetics 85., 203—208., 1977). A pSB86 és a pSB87 plazmid közül — amelyek nem rendelkeznek teljes foszfatáz génnel — az egyik kell, hogy tartalmazza az aktivátor kötési szekvenciáját, és egyben azt a gén-tartományt, amely a lúgos foszfatáz N-terminális végének felel meg. Egy sértetlen kromoszóma phoA génnel rendelkező törzsben ennek a plazmidnak csökkentenie kellene a foszfatáz-képzést, mivel konkurrál a kromoszóma-génnel az aktivátor megkötésében és az aktivátort részben megköti. Most.azt találtuk, hogy a pSB87-tel transzformáit E. coli HB101 törzs ugyanolyan menynyiségű foszfatázt képez, mint a plazmidot nem tartalmazó E. coli HB101 (5,6 egység/ml fermenflé, az előzőekben leírt körülmények között meghatározva), míg a pSB86-tal kezelt E. coli HB101 ennek a mennyiségnek csak kb. 25—30%-át (1,5 egység/ml) termeli. Ennek alapján az a következtetés vonható le, hogy az aktivátor kötési szekvenciája és egyben a phoA gén transzkripciójának kezdete a pSB86 plazmidban található. A pSB53 plazmidban jelenlevő phoA gén transzkripciójának iránya ennélfogva a HindiiI-tól a BamHI szekvencia felé mutat (ez az 1. ábrán az óramutató irányának felel meg); a gén vége (amely a foszfatáz amino-terminálisának felel meg) a 330Bp molekulasúlyú EcoRI fragmentumtól balra, az EcoRI és a Hind 111 szekvencia között kezdődik és a két EcoRI szekvencián keresztül átnyúlik az 121OBp molekulasúlyú XhoI/EcoRI fragmentumba. A pSB53-ban jelenlevő 330Bp molekulasúlyú EcoRI fragmentum kicserélése egy másik DNS-fragmentumra ezért lehetővé teszi — megfelelő orientáció és helyes triplett-rács mellett — olyan fúziós fehérjék előállítását, amelyek az amino-terminálistól az E. coli-ból származó lúgos foszfatáz rész-szekvenciájával kezdődnek. 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
