193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
-(- A 0,2% kazaminosavval dúsított LP táptalajt (K. Kreuzer et al., Genetics 81., 459— 468., 1975) 5%-nyi mennyiségben beoltjuk a plazmidot tartalmazó megfelelő törzs tenyészetével és 23 órán át 37°C-on rázatjuk a tenyészetet (E5oo=7,0). Ezután 1 ml fermentlevet 20 percen át 37°C-on 0,01 ml toluollal rázatunk. A toluollal kezelt sejtszuszpenzióban Kreuzer et al. szerint meghatározzuk a lúgos foszfatázt. A foszfatáz-aktivítást egység/ml fermentlé értékben adjuk meg. 1 egység az az enzim-mennyiség, amely a kísérleti körülmények között percenként E410=1,0 extinkció-növekedést idéz elő.-)-+ Az E. coli HB101 más vektorok nélkül, vagy azokkal együtt ugyanezt a foszfatáz-aktivítást mutatja. A találmány szerinti eljárással előállítható rekombinált plazmidok új, szerkezetüket illetően egyértelműen meghatározható vegyi anyagok. A találmány szerinti plazmidok ezenkívül különösen előnyösen alkalmazhatók plazmid-vektorként eukarióta fehérjék kifejlesztésére E. coli-ban és más baktériumokban annak következtében, hogy fúziós fehérjéket képeznek lúgos foszfatázok N-terminális rész-szekvenciáival. Az alábbiakban még részletesebben rámutatunk arra, hogy milyen előnyöket nyújtanak más plazmid-vektorokkal szemben. A DNS in vitro, plazmid- vagy fág-vektorok alkalmazásával végzett rekombinációjára irányuló eljárás, és az ennek során keletkezett hibrid molekulák transzformáció vagy kereszt-fertőzés révén megfelelő gazdasejtekre való átvitele lehetővé teszi, hogy magasabb eukarióta sejtekből származó DNS-t is átvigyünk, szaporodásra képes alakban, baktériumokra (K.N. Timmis, Progress in Molecular and Subcellular Biology, F.E.Hanh ed., Vol.6., 1.1.—58., Springer Verlag, 1978). Az így transzformált baktériumsejtek azonban általában nem képesek az átvitt eukarióta DNS-ben található géneknek megfelelő fehérjék előállítására. Magasabbrendű eukarióta sejtekből származó gének baktériumokban való kifejlesztése csak különleges plazmid-vektorok alkalmazásával válik lehetségessé, amelyek olyan szerkezetűek, hogy az eukarióta gén beépülhet a plazmidban jelenlevő bakteriális génbe, amely önmagában képes eredményezni egy megfelelő, jól jellemezhető bakteriális fehérje szintézisét. Ha az eukarióta DNS a megfelelő orientációval és a megfelelő triplett-rácsba épül be, az egy ilyen hibrid molekulával való transzformáció segítségével előállított baktériumsejtek olyan fúziós fehérjét termelnek, amely az amino-terminálís részen a bakteriális aminosav-szekvencia egy részével kezdődik, és a karboxil terminális irányában a beépült eukarióta DNS-nek megfelelő aminosav-szekvenciával folytatódik. A fúziós fehérjéből megfelelő enzimológiai vagy proteinkémiai módszerekkel — pl. a kapcsoló7 dási helyen jelenlevő metionin brómcianiddal végzett elbontásával — az eukarióta fehérje nyerhető ki. Egy ilyen polipeptíd-szintézisre az első példát a (14 aminosavból álló) szomatosztatiri peptid-hormon mikrobiológiai úton végzett előállítása szolgáltatta, amelyet egy bakteriális enzimmel, a beta-galaktozidázzal alkotott fúziós fehérje alakjában kaptak meg (K- Bakura et al., Science 198., 1056—1063., 1977). Rövidesen hasonló módon sikerült az emberi inzulin A és B láncának mikrobiológiai szintézise, amelynek során — a szomatosztatin esetéhez hasonlóan — teljesen szintetikus DNS szekvenciákat vittek rá egy beta-galaktozidáz génre (28 48 051, 28 48 052, 28 48- 053 sz. NSZK-beli nyilvánosságrahozatali irat). Egy további példa olyan baktériumtörzsek előállítása, amelyek patkány-inzulint (a bakteriális beta-laktamáz enzimmel képezett fúziós fehérje alakjában) (L. Villa-Komaroff et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75., 3727— 3731., 1978) és egy beta-galaktozidáz szekvenciával rendelkező ovalbumin szerű fehérjét (O. Mercereau-Puijalon et al., Nature 275., 505—510., 1978) termelnek. Ennek a mikrobiológiai polipeptid szintézis módszernek alkalmazhatnak kell lennie más eukarióta peptidek és fehérjék előállítására is, amelyek más módon részben csak nagyon nehezen férhetők hozzá (amilyen pl. az emberi növekedési hormon, az interferon, az aktív immunizáláshoz szükséges vírusfehérjék, specifikus antitestek stb.) A rekombinált DNS alkalmazásával végzett mikrobiológiai polipeptid-szintézisek sikere igen jelentős mértékben függ az alkalmazott vektorok tulajdonságaitól. Az előbbi példákban olyan plazmid vektorokat alkalmazik, amelyeknél az idegen DNS beta-galaktozidáz vagy beta-laktamáz génekbe épült be. Ez a két bakteriális fehérje mint fúziós partner azonban hátrányos is lehet az idegen DNS kifejlesztése szempontjából. A beta-galaktozidázokkal fúziós fehérjék — az eredeti enzimhez magához hasonlóan — megfelelő összetételű táptalajban (beta-galaktozidáz indukció) aránylag nagy mennyiségben ( 105 molekula/sejt) állíthatók elő, a fehérjéket azonban a sejtek pl. nem választják ki a közegbe és ezért ezek csak a sejt feltárása után különíthetők el. A beta-laktamáz és az ezzel képzett fúziós fehérjék a szintézis során a sejtmembránon keresztül a periplazmatikus térbe továbbítódnak, ami egyszerű elkülönítést tesz lehetővé (nincs ugyanis szükség sejt-feltárásra), a kitermelés azonban itt ismét alacsony (kb. 100 molekula/sejt). A találmány tárgyát képezi olyan plazmid-vektorok előállítása is, amelyek lehetővé teszik az idegen DNS-nek a lúgos foszfatáz génbe való beépülését. Az ilyen plazmid-vektorokkal képezett hibrid-plazmidok vagy -fágok segítségével transzformált sejtek ezután olyan fúziós fehérjéket állítanak elő, amelyek aminosav-szekvenciáját egyrészt az alkálikus 8 5 193504 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
