193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
193504 6. példa A pSB86 és a pSB87 plazmid előállítása 5 reakcióelegyet, amelyek összetétele: 5 pl pSB53 (170 pg/ml) 5 pl víz 10 pl EcoRI reakciópuffer és 10 pl különböző EcoRI hígítás 60 percen át 37°C-on inkubálunk és a reakció leállítására 10 percen át 65°C-on tartunk. 1:200, 1:250, 1:320, 1:400 és 1:500 enzim-hígításokat alkalmazunk. Előkísérletben meghatároztuk, hogy az 1:200 hígítás még éppen elegendő a kvantitatív bontáshoz, míg a többi hígítás csak részleges átalakítást eredményez. A reakcióelegyhez hozzáadunk 30 pl következő összetételű oldatot: 20 pl PstI reakciópuffer (30 mM trisz-HCl, 150 mM NaCl, 30 mM NaCl, 30 mM MgCI2, pH 7,0) 10 pl PstI oldat (Biolabs, 1:20 hígítás). Előkísérletben meghatároztuk, hogy a PstI mennyisége a kvantitatív átalakításhoz megfelelő. A keverékeket 60 percen át 37°C-on inkubáljuk, majd a reakció leállítására hozzáadunk egy — 15 pl térfogatú — EDTA-t (100 mM) és szacharózt (400 mg/ml) tartalmazó oldatot és a terméket 0,7% agarózon végzett gélelektroforézissel (1. az 5. példát) elbontjuk. Míg az 1:200 hígítású EcoRI hígítást tartalmazó reakcióelegy 5 DNS sávot mutat (ezek molekulasúlya: 3980, 2030, 1827, 460 és 330Bp), a többi keverék 2 ill. 3 további sávot (ezek molekulasúlya: 2157, 2360 és 4180Bp) eredményez. A 2157 és 2360Bp molekulasúlyú kettős sávot hidroxilapatiton H.F. Tabak, R.A. Flavell módszere szerint (Nucleic Acid Res. 5., 2321—2332., 1978) végzett elektroforetikus abszorpcióval izoláljuk a gélből. Végül a DNS' t a hidroxilapatitról 1M nátriumfoszfát-pufferrel eluáljuk, dializáljuk, 2 térfogat etanollal kicsapjuk és a DNS pufferben feloldjuk. A pBR322 plazmidot ugyanígy reagáltatjuk EcoRI-gyel és Pstl-gyel, de olyan körülmények között, amelyek kvantitatív bontáshoz vezetnek. Az ennek során keletkező két DNS fragmentum közül a nagyobb molekulasúlyú (3610Bp) a fent leírt módon, hidroxilapatiton végzett elektroforetikus adszorpcióval különítjük el. A pSB53-ból és pBR322-ből elkülönített fragmentumok keverékét a 4b. példa szerint T4 ligázzal reagáltatjuk. A reakció termékével transzformáljuk a foszfatáz-negatív E. coli SB44 törzset és a transzformációs keverékből 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L táptalajban dúsítjuk a rezisztens sejteket. A tetraciklin-rezisztens egyes telepeket bélyegzővel átvisszük 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L táptalajra ill. LP táptalajra (K. Kreuzer et al., Genetics 81., 459—468., 1975) és megvizsgáljuk ezek ampicillin-rezisztenciáját és foszfatáz-képzését. Minden sejt 30%-uk ampicillin-érzékeny. 21 12 Az ampicillin-rezisztens sejtek közül ismert eljárásokkal elkülöníthető egy pSB86 jelű plazmid, amely EcoRI-gyel és Pstl-gyel végzett bontás után 3 sávot eredményez; ezek molekulasúlya: 3610Bp (a pBR322-ből), valamint 1827 és 330Bp (a pSB53-ból). Az ampicillin-érzékeny sejtekből elkülönítjük a pSB87-t, amely EcoRI-gyel és Pstl-gyel végzett elbontás után 3 sávot eredményez; ezek molekulasúlya: 3610, 2030 és 330Bp. A pSB86 és a pSB87 restrikciós térképét az la) illetve lb.) ábrán mutatjuk be. 7. példa A pSB50 plazmid előállítása a.) In vitro DNS-kapcsolás A pWB2 vektor-plazmidot, amely egy, a HindlII restrikciós endonukleáz számára hozzáférhető hasítási helyet tartalmaz, és ampicillin- és kolicin-El-rezisztenciát közvetít (W. Boidol, O. Siewert et al., Molec.Gen.Genet. 152., 231—237., 1977), az irodalomból ismert eljárások szerint (G.O. Humphreys et al., Biochem.Biophys.Acta 383., 457—463., 1975) különítjük el. Az E. coli K12 típusú baktériumokból Saito et al. fenol-extrakciós eljárása szerint (Biochem.Biophys.Acta 72., 619—629., 1963), de az RNÁzzal végzett elbontás kiiktatásával különítjük el a nagymolekulájú kromoszóma-DNS-t. A két DNS-féleséget DNS-pufferrel szemben (45 mM trisz-HC1, 0,1 mM EDTA, pH 7,9) dializáljuk és ebben a formában alkalmazzuk tovább. A HindlII restrikciós endonukleáz elkülönítését az irodalomból ismert módon (J.Mól.Bioi. 51., 379—391., 1970 és Eur.J.Biochem. 45., 479—488., 1974) végezzük. A T4 ligázt (100 egység/ml) a Biolabs cégtől (Beverly, Maryland, USA) szerezzük be. Egy reakcióelegyet, amelynek összetétele: 15 pl pWB2 (360 pg/ml DNS) 45 pl kromoszóma-DNS (180 pg/ml) 60 pl HindlII reakciópuffer (20 mM trisz-HC1, 20 mM merkaptoetanol, 20 mM MgCI2, 180 mM NaCl, pH 7,4) és 60 pl hígított HindlII oldat 60 percen át 37°C-on inkubálunk és az enzim-reakció leállítására 10 percen át 65°C-on tartunk. A kvantitatív átalakításhoz szükséges enzim-hígítást előkísérletben határozzuk meg oly módon, hogy mérjük — 0,7%-os agarózban végzett gélelektroforézissel (J.F. Morrow et al., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 71., 1743—1747., 1974) — a gyűrüalakú plazmid-DNS lineárissá való átalakulása mértékét. A fenti (180 pl térfogatú) reakcióelegyhez hozzáadunk 40 pl T4 ligáz-puffert (660 mM trisz-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM ditiotreit, pH 7,6) 40 pl ATP-t (4 mM) 2 pl T4 ligázt és 138 pl H20-t (össztérfogat 400 pl). A keveréket 16 órán át 13°C-on inkubáljuk, kétszer mossuk 400— 400 pl fenollal — amelyet előzetesen TES pufferrel (50 mM trisz-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM 22 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
