193504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lúgos foszfatáz géneket tartalmazó rekombinált plazmidok előállítására és alkalmazására
193504 EDTA, pH 8,0) telítettünk — és DNS pufferrel szemben fenolmentesre dializáljuk. b. ) A pho + sejtek transzformációja és szelekciója Az E. coli phoA mutánsa (SB44 törzs) (1. példa) kompetens sejtjeit a ligációs reakciótermékével reagáltatva transzformáljuk. A kompetens sejtek előállítására Lederberg et al. (J. Bacteriol. 119., 1072—1074., 1974) módosított eljárását alkalmazzuk. A sejteket az 1. példa szerint 100 ml L táptalajban E500 =0,8 optikai sűrűségig tenyésztjük, centrifugáljuk és 100 ml MgCI2 oldatban (100 mM) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 20 percen át 0°C-on tartjuk, centrifugáljuk, a sejteket 50 mM CaCl2 oldatban (30 mM) felvesszük, a szuszpenziót 20 percen át ismét 0°C-on tartjuk, centrifugáljuk, a sejteket 5 ml CaCl2-ban (30 mM) szuszpendáljuk és a további feldolgozásig jégen tartjuk. A transzformációhoz (W. Goebel, R. Bonewald, J. Bacteriol. 123., 658—665., 1975) 200 pl jégbehűtött ligáz reakcióelegyet és 400 pl kompetens sejt-elegyet összekeverünk, majd a keveréket 50 másodpercen át 38°C hőmérsékletű vízfürdőben és 60 percen át 0°C-on tartjuk. 8 ml L táptalaj hozzáadása után a sejteket 2 órán át 37°C-on tartjuk, majd 50 pg/ /ml ampicillint tartalmazó L táptalajba ( 100 ml) visszük át és további 16 órán át 37°C- on tartjuk. Ebből az ampicillines dúsítási elegyből ugyanazzal a módszerrel különítjük el a foszfatáz-pozitív egyes telepeket, amelyet az 1. példa szerint foszfatáz-negatív mutánsok elkülönítésére alkalmazunk. Kb. 10.000 színtelen telep között mindig egy sárga található. c. ) A pSB50 elkülönítése és jellemzése A sárga telepekből egy ismert eljárás (G. O. Humphreys et al., Biochem.Biophys. Acta 383., 457—463., 1975) szerint elkülöníthető egy 22 milliárd molekulasúlyú plazmid, amelyet pSB50-nek nevezünk. Ezt a fentiek szerint reagáltatjuk a HindllI restrikciós endonukleázzal és 0,7% agarózban végzett gél - elektroforézissel (J.F. Morrow et al., Proc. Natl.Acad.Sei. USA 71., 1743—1747., 1974) elemezzük. Két DNS-sáv mutatható ki, amelyek közül a gyorsabban vándorló (7,1 milliárd molekulasúlyú) azonos a lineáris pWB2- vel. A második sáv molekulasúlya kb. 15 milliárd. A pSB50 plazmiddal végzett transzformáció eredményeként valamennyi, az 1. példában említett mtftáns foszfatáz-pozitív lesz. A plazmidnak ezért mind egy phoA, mind egy phoB gént hordoznia kell; ezek az E. coli kromoszómán szorosan egymás közelében helyezkednek el. 8. példa A phoA plazmídok bevitele baktériumtörzsekbe A 2.,3.,4. és 7. példában leírt plazmidokat — pSB47, pSB51, pSB53 és pSB50 — bevisszük foszfatáz-pozitív E. coli K12, E. coli 23 HB101 és S. marcescens, valamint az E. coli SB44 törzsekbe. Ennek érdekében a sejteket a 2. példa szerint kompetenssé tesszük és az izolált DNS-sel transzformáljuk. Az így kapott plazmid-tartalmú törzseket a táblázatban foglaljuk össze, amelyben megadjuk a dereprimált körülmények között fellépő foszfatáz-termelést és összehasonlítjuk ezt a kiindulási törzsek megfelelő értékeivel. Az 1. és 3. ábra jelölései: A restrikciós enzimek által felismerhető szekvenciák jelölésére a következő jeleket alkalmazzuk: I EcoRI 4> HindllI 7 BamHf t Sáli 9 PstL T XhoL További alkalmazott rövidítések: Ap+ ill. Ap~ ampicillin-rezisztencia ill., -érzékenység Tc^ill.Tc- tetraciklin-rezisztencia ill. -érzékenység Pho'1'ill. Phu “ lúgos foszfatáz szintézisére való képesség ill. ennek hiánya Bp bázispár A plazmidok jellemzésében megadott számok bázispárban /Bp/kifejezett molekulasúlyokat jelentenek. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás phoA-gént tartalmazó plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy a) antibiotikum-rezisztens plazmidot és vad típusú baktériumokból származó kromoszóma DNS-t restrikciós endonukleázzal reagálta*unk, az így létrejött hasítási termékek DNS ligázzal 1 igáÍjuk, majd azzal E. coli KI2 HB101 (DSM 1607) törzsből 1-nitrozo-3-nitro- 1-metil-guanidinos kezeléssel nyert E. coli SB 44 (DSM 1606) phoA~-mutánst transznormálunk, és a strukturgént tartalmazó plazmidokat alkalikus íoszfatáz-aktivítás alapján zoláljuk, vagy b) az a) eljárás szerint előállított plazmidokból phoA-gént tartalmazó frakciókat hasítunk ki restrikciós enzimekkel, és valamely antibiotikum-rezisztens vektorplazmidokkai rekombináljuk, DNS-ligáz alkalmazásával. 2. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás pSB53 (ATCC 40020) jelű plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy pSB18 (ATCC 40016) jelű antibiotikum-rezisztens plazmid vektort és pSB47 (ATCC 40057) vagy pSB50 (ATCC 40018) phoA-plazmidokat BamHI és HindllI restrikciós endonukleázokkal reagáltatunk, és az így kapott fragmenseket egymással kapcsoljuk. 3. Eljárás pSB86 (DSM 1874) plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint előállított pSB53 (ATCC 40020) plazmidot Pstl-el, majd részlegesen EcoRI-el 24 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
