193406. lajstromszámú szabadalom • Eljárás affinitás-szorbensek előállítására
A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű új áffinítás-szorbensek előállítására P - A - CO - NH - B (I) — a képletben P 10 000 és 100 000 közötti polimerizációfokú, affinitáskrorpatográíiai célokra alkalmas poliszacharid-típusú hordozót, célszerűen agarózt vagy cellulózt, vagy akril-amid telítetlen karbonsavval képezett, divinil-vegyülettel térhálósított, 10 000 és 100 000 közötti polimerizációfokú kopolimerjét jelenti az -A-COOH oldallánc nélkül, A - (CH2)„-csoportot jelent, ahol n értéke 1 és 10 közötti egész szám, és B egy aminosav, polipeptid vagy neurotranszmitter-karbonsav maradékát jelenti az -NH2 végcsoport nélkül. Az aminosavak, polipeptidek (beleértve a di- és oligopeptideket is; ezek jellemző képviselői a hormonok) és a neurotranszmitter-karbonsavak immobilizálása polimer hordozón több szempontból is nagy jelentőségű, mert a tudományos kutatásban sokoldalúan felhasználható szorbenseket eredményez. Ezek a szorbensek felhasználhatók affinitáskromatógráfia céljára, a hormonok szolubilizált receptorainak tisztítására, hormonokkal mint antigénekkel szemben nyert antiszérumok tisztítására, antitestek izolálására, enzimek izolálására és tisztítására. Ezen kívül a megfelelő aífínitás-szorbensek segítségével az immóbilizált hormon és receptora közötti kölcsönhatás alapján élő sejtek is tisztán izolálhatok. Ha az affinitás-szorbenseket mikroszkóp tárgylemezén élő sejtek szuszpenziójával inkubálják, majd mikroszkóppal vizsgálják a sejtek kötődését az affinitás-szorbensen, megállapítható, hogy az adott sejttípus tartalmazza-e a vizsgált receptorokat a sejtmembránon (affinitás-mikroszkópia). Az affinitás-szorbensek adott hormonnal, illetve neurotranszmitterrel szemben termelt antiszérum fajlagosságának ellenőrzésére, antitestek specifitásának kvalitatív és kvantitatív érzékelésére, továbbá egyes esetekben (így autoimmun betegségeknél) gyógyászati célokra is alkalmazhatók. Mindezen felhasználási területek szempontjából alapvető fontossága van annak, hogy az affinitás-szorbens a rajta immobilizált aminosav-, peptid- vagy neurotranszmitter-karbonsav-molekulákat kémiailag egységes és biológiailag aktív állapotban tartalmazza. Az affinitás-szorbensek előállításához hordozóként csak hidrofil polimerek használhatók fel. Erre a célra a legszélesebb körben különféle poliszacharidokat (agaróz, cellulóz stb.) alkalmaznak. Az eddig ismert megoldások szerint a biológiailag aktív molekulát aminocsoportján keresztül kapcsolták a hordozóhoz, például úgy, hogy agarózra előzetesen brómciánnal e-amino-kapronsavat vittek fel, az így kialakított, karboxil funkciós csoportokat tartalmazó hordozó funkciós csoportjait N-hidroxi-szukcinimidészterré alakították, és az aktív észterhez kapcsolták aminocso- 2 1 portjukkal a rögzítendő aminosavat, pepiidet vagy neurotranszmittert. Ennek a megoldásnak a hátránya, hogy több aminocsoportot tartalmazó, biológiailag aktív molekulák többféle módon is kapcsolódhatnak a hordozóhoz, azaz a végtermék nem tartalmazza a felvitt biológiailag aktív molekulákat kémiailag egységes állapotban. Szükség van tehát olyan eljárásra, amelylyel a kémiailag egységes szerkezetű (tehát az összes felvitt molekulát azonos módon megkötve tartalmazó) affinitás-szorbensek a felvitt molekula biológiai aktivitásának csökkenése nélkül állíthatók elő. Kézenfekvő olyan védett aminosavnak vagy peptideknek a felhasználása, amelyek csak egyetlen szabad aminocsoportot tartalmaznak, míg az összes többi reakcióképes csoport (amino-, hidroxilvagy merkaptocscport) védett formában van jelen. Nehézségek származnak azonban abból, hogy az affinításkromatográfiai célokra felhasználható polimer hordozóknak hidrofil anyagoknak kell lenniük; ezek azonban savakra rendkívül érzékenyek. Sav hatására a poli szacharid váz sérül, hidrolízist és bomlást szenved, így ha a védett csoportokat tartalmazó, biológiailag aktív molekulát a poliszacharid vázhoz kapcsoljuk, majd az aminocsoportok és az egyéb funkciós csoportok védőcsoportjait ismert módon erős savas kezeléssel lehasítjuk, a végtermék olyan szerkezeti változásokon megy keresztül, amelyek hatására affinitáskromatográfiai célokra alkalmatlanná válik. A szilárd fázisú peptid-szintézisben felhasznált polisztirol-alapú, savra rezisztens hordozóanyagok affinításkromatográfiai célokra nem jöhetnek szóba, mert ezek hidrofób jellegűek. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy ha a) a poliszacharid-hordozón egy szabad aminocsoportjuk igénybevételével immóbilizált aminosavak, neurotranszmitter-karbonsavak vagy polipeptidek egyéb aminocsoportjain és adott esetben egyéb funkciós csoportjain lévő, savval lehasítható védőcsoportokat speciális körülmények között távolítjuk el, vagy b) az aminosavak, neurotranszmitter-karbonsavak vagy polipeptidek immobilizálásához az affinitáskromatográfiában eddig még fel nem használt, hidrofil, ugyanakkor azonban savakkal szemben megfelelően ellenálló akril-kopolimert használunk, a felsorolt problémák teljes egészükben kiküszöbölhetők. A találmány tárgya tehát eljárás az (I) általános képletű új affinitás-szorbensek előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy (II) általános képletű polimer hordozóhoz P - A - COOH (II) a képletben P és A jelentése a fenti — aktív észter-módszerrel egy (III) általános képletű aminosav, polipeptid vagy neurotranszmitter-karbonsav 2 193406 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
