193381. lajstromszámú szabadalom • Eljárás adenozin-3',5',-ciklofoszfát tartalom radioimmunológiai meghatározására és az ehhez alkalmazott radioligand előállítására
kiindulási anyag feloldásától kezdve a reak ció lezajlásáig a reakciótérben folyamatos argon-áramoltatással inert atmoszférát tartunk fenn. A reakció lezajlása után az oldószert az 1. példában megadott módon ledesztilláljuk, a maradékot 0,1 ml etanolban feloldjuk és kromatografáljuk DC Plastikfolien PEI Cellulose F rétegen (Merck, 20x20x x0,25 cm), háromkomponensű — n-butanol: :ecetsav:víz 12:5:3 arányú — elegy rázótölcsérben elválasztott felső fázisában, majd a réteget az inaktív szukcinil-c-AMP-tirozin-metilészterrel azonos fy ér.tékü radioaktív csúcshelyein lekaparjuk és 50 ml háromkomponensű eleggyel 4°C hőmérsékleten 12 órán át eluáljuk. Ezután az oldatot 0,02 bar (15 mmHg) nyomáson bepároljuk, a maradékot 100 ml etanolban feloldva törzsoldatot készítünk, amelynek radioaktivitása b-köztitermékbő! kiinduló szintézis esetén 24,88 mCi és a-köztitermékből kiinduló szintézis esetén 17,45 mCi. Mindkét termék radiokémiái tisztasága — vékonyrétegkromatográfiás ellenőrzés tanúsága szerint — 95%-osnál jobb. Ha a kétféle termék jelzőanyagkénti hatékonyságának a kétféle moláris aktivitás számtani átlagát tekintjük, a kitermelés b-köztitermékből 32,2% a-köztitermékből 28,6%. 6. példa Agyszövetminta c-AMP tartalmának antitest-antigén reakciós meghatározása ( Ib) képlett! radioligand alkalmazásával 20 pM koncentrációjú c-AMP törzsoldatból 0,005 M nátrium-acetát pufferoldatban (pH= =4,75) hígítási sorozatot készítünk úgy, hogy 1 — Imi térfogatú oldatmintákat kapjunk, amelyek c-AMP koncentrációja 0,5—1,0—2,0—5,0- — 10—20 nM, illetve 25—50—100—250— —500—1000 fmól/cső. 50 mg nedves szövetet 1 ml 5%-os triklór-ecetsavval homogenizálunk, majd centrifugáljuk, és a felülúszót háromszor extraháljuk 1 — 1 ml etíléterrel, majd 50°C hőmérsékleten kb. 10 percig rázzuk (oldószermentesítés céljából). Az így kapott biológiai mintákból ugyanezen pufferoldatban ugyancsak 1 — 1 ml térfogatú mintaoldatokat készítünk. A standard-, illetve mintaoldatokat 20 pl trietil-aminnal 1 percen át kevertetjük, majd 10 pl ecetsavanhidridet adunk hozzá és egy perces keverés után 20°C hőmérsékleten félórán át állni hagyjuk. Ezután sorszámozott polietilén- vagy üveg kémcsövekbe automata pipettával bepipettázunk kb. tízezer cpm beütésszámú (500 Bq radioaktivitású) (1b) képletű triciált tirozin-metilészter-c-AMP-t tartalmazó — a fenti szerinti összetételű — 0,1 ml pufferoldatot, s a standard-, illetve mintaoldatokból egyaránt 0,05 ml-nyit, valamint 0,5% BSA-t tartalmazó 0,05 M nátrium-acetát pufferoldatban (pH= =4,75) feloldott 0,2 ml kecske anti-c-AMP hnmunsavót olyan hígításban, hogy a Bo/TC érték 40 és 50% közötti legyen, majd a kémcsövek tartalmát vortex keverővei (KUTESZ 6 9 gyártmánya) néhány másodpercig kevertetjük. A hígítási sorozat mindegyik tagjának megfelelő 3—3 mintát párhuzamosan vizsgálunk egyidejűleg. A nem specifikus kötődés (NSB) meghatározására további három kémcsőbe az antiszérum helyett tiszta pufferoldatot, a 0 standard mérésére pedig a standardoldatok helyett 0,05 ml tiszta pufferoldatot pipettázunk a radioligand mellé. A 0 standarddal azonos összetételű mintát tartalmazó további három kémcsövet a teljes radioaktivitás (TC) mérésére alkalmazunk. A kevertetés befejezése után a kémcsöveket hűtőszekrényben hagyjuk állni (+4°C körüli hőmérsékleten) egy éjszakán át, majd jégvizes hűtés közben a TC mérésére szolgáló kémcsövek kivételével hozzápipettázunk 1 — 1 ml — 0,25%-os BSA-t tartalmazó — 0,2%-os, 0°C hőmérsékletű csontszén • szuszpenziót [Norit-A, Serva (NSZK) gyártmány]. A TC mérésére szolgáló csövekbe ehelyett ezzel egyező térfogatú és összetételű tiszta pufferoldatot pipettázunk. A kémcsöveket 15 percig állni hagyjuk a hűtőszekrényben, majd 4°C hőmérsékleten tíz percen át centrifugáljuk 1500 g gyorsulással, és a felülúszókból 0,5—0,5 ml-nyit pipettázunk folyadékszcintillációs mérőedényekbe. A kivett mintákhoz 10—10 ml szcintillációs elegyet töltünk, amelynek összetétele 1 liter dioxánban oldott 120 g naftalin, 4 g 2,5-difenil-oxazol (PPO) és 0,3 g p-bisz [2-(5-fenil-oxazolil) ]-benzol (POPOP) és a radioaktivitást ismert folyadékszcintillációs módszerre] mérjük. A számítást is a radioimmunassay eljárásban szokásos módon végezzük. Az 1. ábrán mutatjuk a felvett diagramot, a B/Bo százalékos arányt a pmót/cső függvényében. 7. példa Agyszövetminta c-AMP tartalmának antitest-antigén reakciós meghatározása (la) képletű radioligand alkalmazásával A 6. példa szerint járunk el azzal az eltéréssel, hogy radioligandként nem (Ib) képletű, hanem (la) képletű vegyületet alkalmazunk. Ellenőrzésképpen a példát megismételjük olyan radioliganddal, amely az (Ib) képietűtől abban tér el, hogy az oldallánc tirozilcsoportja inaktív (úgy állítottuk elő, hogy a B Folyamatábra szerinti szintézisben inaktív tirozin-metilészter kiindulási anyagot alkalmaztunk a (IV) képletű triciált tirozin-metilészter helyett). A 2. ábra mutatja egymással egybevethető módon azokat a B/Bo kötésfüggvényeket, amelyeket az (la) képletű, az (Ib) képletű, illetve az oldalláncában inaktív tirozin-metilésztert tartalmazó radioligandokkal kaptunk, míg a 3. ábra megfelelően mutatja a Bo/TC görbéket a c-AMP koncentráció függvényében. Különösen szembetűnő az érzékenység javulása. A fentiekből a szakember felmérheti a találmány előnyeit a technika állásához képest. Az előnyökből kiemeljük: 10 193381 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
