193381. lajstromszámú szabadalom • Eljárás adenozin-3',5',-ciklofoszfát tartalom radioimmunológiai meghatározására és az ehhez alkalmazott radioligand előállítására
Az alkalmazott radiokémiái szintézisek segítségével kedvező feltételek között előállíthatunk olyan radioligandot, nevezetesen az (I) képletű triciált TME-szukeinil-c-AMP származékot, amelynek nagy moláris aktivitása biztosítja a minták c-AMP koncentrációjának hatékony radioimmunológiaí meghatározását. Ezt az oldallánci csoportok előzetes jelzésével érjük el, így nincs szükség c-AMP molekula radiokémiái szintézisére. A találmány szerinti eljárásban úgy optimálható az oldószerek összetétele és aránya, a hőmérséklet, a reagensek és a katalizátorok adagolása, hogy a radiokémiái szintézisben a radioaktív jelzés paraméterei a lehető legkisebb izotópkiépülést biztosítják. Az alkalmazott radiokémiái szintézis paraméterei másfelől ügy választhatók meg, hogy a lehető legkevesebb radioaktív művelettel, a lehető legkisebb lépték mellett (legfeljebb néhány mg-nyi adag) kielégítően nagy kémiai és radiokémiái kitermelést érjünk el. A tríciummal jelzett új radioligand alkalmazása olyan c-AMP radioimmunassay megvalósítását teszi lehetővé, amely a hosszú felezési idejű tricium izotóp használata folytán megőrzi a technika állása szerinti protein binding assay alkalmazásával elért méréstechnikai és gyártástechnológiai előnyöket, ugyanakkor lényegesen nagyobb érzékenységet biztosít a specifikus antitestek alkalmazásának előnyei mellett. SZABADALMI .IGÉNYPONTOK 1. Eljárás biológiai szövetminta (szövet, vér, vizelet, stb.) adenozin-3\5’-ciklofoszfát (továbbiakban: c-AMP) tartalmának antitest-antigén reakciós meghatározására ismert mennyiségű, hígítási sorozat szerint különböző koncentrációjú (előnyösen acetilezett) c-AMP származék és a meghatározandó (előnyösen acetilezett) biológiai közegminta jelenlétében, amelynek során megmérjük a nagy fajlagos aktivitású radioaktív nyomjelző vegyületnek (továbbiakban: radioligand) specifikus antitesttel való kötődését és az ismert mennyiségű (előnyösen acetilezett) c-AMP hígítási sorozat által okozott kötésváltozás alapján számítjuk a mindenkori közegminta hatóanyagtartalmát, azzal jellemezve, hogy radioligandként (I) általános képletű 2’-0 -[2”,3”-3H2j - szukcinil-c-AMP származékot alkalmazunk, amely képletben R jelentése hidroxilcsoport vagy L- [3,5-3H] -metil-tirozilcsoport. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy háromezer és harmincezer, előnyösen hatezer és tizenkétezer közötti cpm beütésszámú radioligandot alkalmazunk. 11 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként kecskében előállított anti-c-AMP immunsavót alkalmazunk olyan mennyiségben, amely az inaktív (nem-jelzett) c-AMP-t nem tartalmazó mintában a radioligand 40—60, előnyösen 50%-át képes megkötni. 4. Az 1—3. igénypontok bárme.lyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pufferoldatként —- szérumalbumint, előnyösen szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó — nátrium-acetát oldatot alkalmazunk, amelynek pH-ja 4 és 8 közötti, előnyösen 4,75 körüli, és amelynek mennyisége 0,1 és 1 térfogatszázalék közötti, előnyösen 0,5 térfogatszázalék. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióidő 1 és 50, előnyösen 3 és 20 óra közötti és a reakció hőmérséklet 0 és 40°C közötti. 6. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a közegminták és az inaktív c-AMP szer acetilezését ecetsavanhidrid reagenssel, tercier amin, pl. trietil-amin jelenlétében végezzük. 7. Eljárás (I) általános képletű 2’-0- [2”,3- -3H2]-szukcinil-c-AMP származék előállítására, amely képletben R jelentése hidroxilcsoport vagy L- [3,5-3H] -metil-tirozilcsoport, azzal jellemezve, hogy (11) képletű triciált borostyánkősavanhidridet adenozin-3’,5’-ciklofoszfáttal vagy annak sójával, előnyösen nátriumsójával reagáltatunk és kívánt esetben a kapott, az (I) általános képlet körébe tartozó (la) képletű reakcióterméket (IV) képletű [3,5-3H] -tirozin-metilészterrel reagáltatjuk poláros oldószerben, tercier amin, pl. trietilamin és klór-hangyasav-etilészter jelenlétében. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) képletű kiindulási anyagot az adenozin-3’,5’-ciklofoszfáttal (annak sójával) trietil-amin és aceton — célszerűen 1:4 térfogatarányú — elegyében reagáltatjuk, és az adenozin-3’,5’-ciklofoszfátot (annak sóját) célszerűen a (II) képletű kiindulási anyag egy móljára számított 0,1 — 0,3, előnyösen 0,15 mólarányban alkalmazzuk. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (la) képletű triciált reakcióterméket a (IV) képletű triciált tirozinszármazékkal dimetil - formamidban reagáltatjuk. 10. A 7—9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (la) képletű reakcióterméket és a (IV) képletű tirozinszármazékot tartalmazó reakeióelegyet szobahőmérsékleten kevertetjük, és a reakcióidő négy és tíz óra közötti, előnyösen hat óra. 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
