193381. lajstromszámú szabadalom • Eljárás adenozin-3',5',-ciklofoszfát tartalom radioimmunológiai meghatározására és az ehhez alkalmazott radioligand előállítására
3 193381 4 Ennek során úgy járunk el, hogy a radioligandnak specifikus antitesthez való kötődését mérjük ismert mennyiségű, különböző koncentrációjú (előnyösen acetilezett) c-AMP jelenlétében, majd az így kapott értékekből az ismeretlen (előnyösen acetilezett) közegminták által okozott kötésváltozásokhoz tartozó c-AMP koncentrációkat kiszámítjuk. Ehhez a radioligandot, továbbá a hígítást sorozat szerint eltérő mennyiségű inaktív c-AMP-t és specifikus antitestet tartalmazó pufferoldatot inkubálunk, majd az antitesthez kötött, illetve nem kötött frakciókat elválasztjuk és mérjük a kötött frakciók radioaktivitását. Az oldat konkrét összetételétől függően az inkubációs hőmérséklet 0 és 40°C közötti, az inkubáció időtartama 1 és 50, előnyösen 3 és 20 óra közötti. Általában háromezer és harmincezer, előnyösen hatezer és tizenkétezer közötti cpm beütésszámú radioligandot alkalmazunk, amelyet célszerűen úgy készítünk ki, hogy pufferoldatot tartalmazó sorszámozott kémcsövekbe töltjük a meghatározott, előnyösen pl. tízezer cpm beütésszámú (500 Bq radioaktivitású) (I) képletű radioligandot és a megfelelő sorszámú kémcsőbe pipettázunk a mindenkori hígítási aránynak megfelelően 0—25—50—100—250—500—1000 fmól (10*15 mól) mennyiségű (előnyösen acetilezett) c-AMP-t és a meghatározandó (előnyösen acetilezett) biológiai mintát; célszerűen azonos hígítással 3—3 mintát vizsgálunk párhuzamosan. A pufferoldat célszerűen 0,1 — 1 térfogatszázaléknyi (tf%) szérumalbumint, előnyösen szarvasmarha szérumalbumint (BSA) tartalmazó 0,01—0,2 M, előnyösen 0,05 M nátrium-acetát-oldat, amelynek mennyisége 0,1 és 1 tf% közötti, előnyösen 0,5 tf%. Általában ezt az antitest-antigén reakciót savas közegben célszerű végezni, előfordulhat, hogy enyhén lúgos közegben eredményes, így a pufferoldat pH-ját 4 és 8 közötti értékre állíthatjuk, az előnyösen 4,75 körüli. A specifikus antitest célszerűen magas titeríí (pl. 103—104-szeres hígítású) anti-c-AMP immunsavó, amelyből annyit alkalmazunk, amennyi az inaktív c-AMP-t nem tartalmazó mintában a radioligand 40—60, előnyösen kb. 50%-át képes megkötni. A minták és az inaktív c-AMP acetilezését célszerűen ecetsavanhidrid reagenssel, trietil-amin jelenlétében végezzük, pl. úgy, hogy azokat kb. 20 tf% trietil-amint tartalmazó 0,005 M nátrium-acetát pufferoldatban (pH= =4,75) 10 tf% ecetsavanhidriddel reagáltatjuk; a reakció hőmérséklet előnyösen 20— 25°C, a reakcióidő előnyösen 30 perc körüli. Az anti-c-AMP immunsavó készítéséhez és a minták és az inaktív c-AMP acetilezéséhez előnyösen a Brooker et al [Adv. in Cyclic Nucleotide Res., 10, (1979) 1] által ismertetett módszert alkalmazhatjuk. A kötött, illetve nem kötött radioligand frakciók elválasztásához előnyösen 0,25% BSA-t és 0,2% csontszenet tartalmazó 0,1 M kálium-foszfátos pufferoldatot [pH=6,8] alkalmazunk. A 0,15% végkoncentrációjú csontszén megköti a radioligand nem kötött frakcióját és a centrifugálás után felülúszóként kapott kötött frakciót folyadékszcjntillációs módszerrel mérjük. A találmány tárgya továbbá eljárás a radioligandként alkalmazható (I) általános képletű 2’-0- [2”,3”-3H2] -szukcinil-c-AMP származékok előállítására. A találmány szerint az (I) általános képletű triciált c-AMP származékokat úgy állítjuk elő, hogy (II) képletű triciált borostyánkősavanhidridet adenozin-3’,5’-ciklofoszfáttal vagy annak sójával, előnyösen nátriumsójával reagáltatunk,és kívánt esetben a kapott reakcióterméket (IV) képletű [3,5-3H] -tirozin-metilészterrel reagáltatjuk poláros oldószerben, tercier amin, pl. trietil-amin és klór-hangyasav-etilészter jelenlétében. (Az A Folyamatábra azt a foganatosítási módot szemlélteti, amelynél a (II) képletű kiindulási anyagot (III) képletű c-AMP-nátriumsóval reagáltatjuk) . A (II) képletű kiindulási anyagot a továbbiakban ismertetendő kétféle eljárásváltozattal is előállíthatjuk, amely változatok egyike szerint kapott termék moláris aktivitása 30—50 Ci/mmól, míg a másik eljárásváltozatban kapott termék moláris aktivitása 70 -80 Ci/mmól. így az első lépésben szintetizált (la) képletű céltermék moláris aktivitása is lehet eltérő, 30—80 Ci/mmól tartományon belül. A (IV) képletű kiindulási anyag a továbbiakban ismertetendő szintézissel úgy állítható elő, hogy annak moláris aktivitása 40 -50 Ci/mmól, így a második lépésben kapóit (Ib) képletű céltermék moláris aktivitása 70—130 Ci/mmól. Külön előnye a találmány szerinti eljárásnak, hogy a kiindulási anyagok előállítása során nincs szükség a c-AMP radiokémiái szintézisére (triciálására), és hogy a két triciált reagens alkalmazásával az (Ib) képletű célterméket eredményező totálszintézis szobahőmérsékleten mehet végbe. Az (la) képletű vegyület szintézisében oldószerként célszerűen trietil-amin és aceton elegyét alkalmazzuk, előnyösen 1:4 térfogatarányban, a (II) képletű kiindulási anyag egy móljára számított 8—15, előnyösen 10 mólnyi mennyiségben. A c-AMP(só)t a (II) képletű kiindulási anyag móljára számított 0,1—0,3, előnyösen 0,15 mólnyi mennyiségben alkalmazzuk. A kapott reakcióelegyet savanyítjuk, a kivált csapadékot leszűrjük. A savanyításhoz előnyösen 2M sósavat alkalmazunk. A csapadékot mossuk és szárítjuk, a kapott (la) képletű vegyületet alkalmazhatjuk radioligandként az immunokémiai reakcióban vagy az (Ib) vegyület szintéziséhez kiindulási anyagként. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
