193381. lajstromszámú szabadalom • Eljárás adenozin-3',5',-ciklofoszfát tartalom radioimmunológiai meghatározására és az ehhez alkalmazott radioligand előállítására
193381 A találmány tárgya eljárás biológiai szövetminta (szövet, vér, vizelet, stb.) adenozin-3’,5’-ciklofoszfát (továbbiakban: c-AMP) tartalmának radioimmunológíaí meghatározására ismert rnennyiségű, különböző koncentrációjú (előnyösen acetilezett) c-AMP származék és a meghatározandó (előnyösen acetilezett) biológiai közegmintá/k/ jelenlétében, amelynek során megmérjük a nagy fajlagos aktivitású radioaktív nyomjelző vegyületnek (továbbiakban: radioligand) specifikus antitesttel való kötődését és az ismert mennyiségű (előnyösen acetilezett) c-AMP hígítás! sorozat által okozott kötésváltozás és az (előnyösen acetilezett) közegminta által okozott kötésváltozás alapján számítjuk a mindenkori közegminta hatóanyagtartalmát. A találmány szerint ebben az immunokémíai reakcióban radioligandként egy önmagában ismert c-AMP származék találmány szerinti triciálásával kapott új szerkezetű vegyületet alkalmazunk. A találmány tárgya továbbá ennek az új szerkezetű radioligandnak az előállítására szolgáló eljárás. A c-AMP az élő szervezetekben előforduló, biológiailag aktív vegyület: a hormonok és ingerületátvivők hatásának ún. másodlagos hírvivője [részletesen tárgyalja pl.: Recent Prog. Hormone Res., 21, (1965) 623—646]. A c-AMP mennyiségének érzékeny, pontos meghatározása rendkívül fontos az endokrinológiai, neurokémiai és farmakológiai kutatások szempontjából. A c-AMP meghatározás több módszerét ismerteti az irodalom. AJ. Biol. Chem., 247, (1972), 1106—1113, illetve a Biochem. J., 121, (1971), 561—562 források ismertetik az ún, protein binding assay eljárás két változatát, amelyek szerint vázizomból vagy mellékveséből izolálnak fehérjefrakciót, és figyelik egyfelől a tricium-jelzett 3H-c-AMP, másfelől a nem-jelzett c-AMP vetélkedését az izolált fehérjefrakció kötés-helyein. A módszer hátránya, hogy nem elég érzékeny, mérési tartománya 1 —16 pikomól; előnye viszont a hatóanyag tartóssága: felezési ideje mintegy 12 év. Egy másik forrás [Adv. in Cyclic Nucleotide Res., 10, (1979), 1—33; Raven Press, New-York] olyan eljárást ismertet, amelynél a radioimmunassay-ben kötőfehérjeként alkalmazott specifikus antitest képződését 2’-0-szukcinil-c-AMP-nek testidegen fehérjékkel alkotott konjugátumaival váltják ki állatokban. Radioligandként a c-AMP-nek 125 tömegszámú jóddal jelzett 2’-0-szukcinil-tirozin-metilészterét használják. A mérés ezen radioligandnak és a nem-jelzett (adott esetben acetilezett) c-AMP-nek az antitest kötéshelyeiért való vetélkedésén alapul. Ennek a módszernek az előnye, hogy jobb az érzékenysége, mérési tartománya kb. 0,01—0,2 pikomól és az alkalmazott antitest igen olcson, nagy mennyiségben előállítható és hosszan tárolható, 1 9 ezáltal folyamatos felhasználást tesz lehetővé; a módszer hátránya, hogy a jód felezési ideje rövid, mindössze 60 nap. A találmány alapja az a felismerés, hogy e két módszer előnyei egyesíthetők azok hátrányai nélkül, ha az immunokémiai reakcióban radioligandként a c-AMP önmagában ismert származékainak új módon való jelzésével kapott (I) általános képletű 2’-0- [2”,3” - -3H2]-szukcinil-c-AMP származékok valamelyikét alkalmazzuk, amely képletben R jelentése hidroxilcsoport vagy L- [3,5-3H]-metil-tirozilcsoport; ezeknek a radioligandoknak hoszszú a felezési idejük (12,3 év), nagy a moláris aktivitásuk [70—130 Ci/mmól] és az ugyancsak találmányunkat képező szintetizáló eljárással ezek a radioligandok kedvező feltételek között állíthatók elő. Tapasztalati tény, hogy a c-AMP alapmolekula a specifikus antitesthez rosszul kötődik; az alapmolekula triciálása problematikus^és az alapmolekula triciált formája ebben az immunokémiai reakcióban radioligandként akkor sem lenne alkalmazható, ha annak fajlagos aktivitását növelni lehetne. A c-AMP molekula szukcinil származékai viszont nagyságrendekkel jobb kötődést biztosítanak [Anal. Biochem., 56, (1973), 383—393] ; felismertük, hogy a c-AMP szukcinil származékai egy új szintézis keretében jól triciálhatók és az immunokémiai reakció hatékonysága javítható, ha az így kapott (I) általános képletű vegyületek valamelyikét alkalmazzuk radioligandként. Felismerésünk szerint az (I) általános képletű triciált c-AMP származékok kedvező feltételek között úgy állíthatók elő, hogy előbb triciummal jelzünk az (I) általános képletű vegyület oldalláncának szukcinilcsoportjává konvertálható vegyületet, majd a triciált vegyületet (II) képletű triciált borostyánkősavanhidriddé konvertáljuk, és ezzel reagáltatjuk az inaktív c-AMP alapmolekulát vagy annak sóját, előnyösen nátriumsóját, tgy kapjuk az (I) általános képlet körébe tartozó (la) képletű célterméket, amelyet közvetlenül is alkalmazhatunk radioligandként, továbbá kívánt esetben úgy konvertálhatunk még nagyobb moláris aktivitású (Ib) képletű céltermékké, hogy reagáltatjuk (IV) képletű triciált tirozin-metilészterrel. A kétféle (I) általános képletű radioligandot tehát úgy állíthatjuk elő, hogy a c-AMP-t inaktív szerkezetében alkalmazhatjuk kiindulási anyagként: elkerülhető a c-AMP molekula radiokémiái szintézise, az alapmolekula triciálása. Az (la) képletű céltermék szintézisének lépéseit az A Folyamatábra, az (la) — (Ib) konverzió lépéseit a B Folyamatábra szemlélteti. A találmány tárgya tehát antitest-antigén reakciós meghatározási eljárás, amely az ismert és a fentiekben körvonalazott radioimmunassay eljárástól abban különbözik, hogy radioligandként új szerkezetű, (I) általános képletű tricium-jelzett c-AMP származékot alkalmazunk. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
