193294. lajstromszámú szabadalom • Kérődzők emésztését előnyösen befolyásoló készítmény
193294 10 fie Societies Press, Tokyo, (1981) ) tenyésztjük 120 órán át, majd az egyedi telepekről szénakivonatot tartalmazó alábbi összetételű tápta9 lajt oltunk: Sóoldat I. (lásd előbb) 15,0 % Sóoldat II. (lásd előbb) 15,0 % Reszazurin, 0,1 %-os oldat 0,1 % Tripton L42 (Oxoid)+ 1,5 % Élesztőkivonat (Oxoid)+ 0,5 % Bendőfolyadék++ 10,0 % Nátrium-karbonát 0,4 % Cisztein-hidroklorid-monohidrát 0,05 % Szénakivonat+++ 10,0 % Jele: RGCF. + Oxoid Limited, London, Anglia. ++Lásd előbb. + ++A szénakivonat előállítására az apróra vágott növénydarabokat vízben szuszpendáljuk, majd forralást követően szűrjük. A szűrési maradékot sterilezés előtt adagoljuk a táptalajhoz. A táptalaj pH-ját hidrogén-klorid oldattal 6,5-re állítjuk be, majd sterilezzük. A kémcsövekben sterilezett 5 ml térfogatú táptalajokat beoltjuk az RGCA szilárd halmazállapotú táptalajon kinőtt izolált telepekről nyert sejtszuszpenzióval, és 5 napon át, 35°C hőmérsékleten, anaerob körülmények között inkubáljuk a tenyészeteket. Mikroszkópos vizsgálattal ellenőrizzük a növekedést, majd az előzőekben megadott RGCA jelű szilárd halmazállapotú táptalajra szélesztjük a tenyészetet, azonban a táptalajba glükózt és cellobiózt nem adagolunk, ezek helyett 2,0% Bacto cellulózt mérünk be. A tenyészeteket 35°C hőmérsékleten inkubáljuk 120 órán át, majd a cellulózt .hasznosítani képes sejtekből kifejlődött egyedi telepeket cellulózt tartalmazó RGCA táptalajokra izoláljuk. így olyan, bendőből származó mikroorganizmusokhoz jutunk, amelyek szénán, illetve cellulózon növekedni képesek. B.) Szénát bontó bendőbaktériumok genetikai jelölése A genetikai jelölést a plOl 1 Escherichia coli plazmiddal (Simon és munkatársai, Proc. of the Eight North American Rhizobium Conference, Winnipeg, Canada: Univ. of Maniota Press, (1983)) végezzük, önmagában ismert módon. Az E. coli tenyészetből Bimbóim és Doly szerint (Nucl. Acids Res., 7, 1513 /1979/) izoláljuk a plazmid DNS-t, majd az alábbi elegyben oldjuk: 75 mM kalcium-klorid 5 mM magnézium-klorid 10 mM TRISZ-hidrogén-klorid puffer+ pH 7,5. + (Trisz- (hidroxi-metil) -amino-metán )-hidrogén-klorid Az 1. példa A. pontjában megadottak szerint izolált, szénán növekedni képes mikro-6 organizmusokat RGCF táptalajon (lásd az 1. példa A. pontját) tenyésztjük, majd centrifugálással széndioxid alatt elkülönítjük. A sejteket az alábbi elegyben szuszpendáljuk: 5 75 mM kalcium-klorid 5 mM magnézium-klorid 10 mM TRISZ-hidroklorid puffer pH 7,5 1 mM cisztein-hidroklorid-monohidrát 1 mM nátrium-tioszulfát. 10 A szuszpenziók milliliterenként 5xlOa sejtet tartalmaznak. A sejtszuszpenziókat 1:1 arányban hígítjuk a plOl 1 plazmid DNS-t tartalmazó (0,1 pg/ul) eleggyel, majd 4°C hőmérsékleten inkubálunk 60 percen át. Az inku- 15 hálást ezután két percen át 41°C hőmérsékleten folytatjuk, és ezt követően szénforrásként cellulózt tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajokra szélesztjük a tenyészetet, amely táptalajokhoz sterilezés előtt 500 pg/ml kana- 20 micin B-t adagoltunk. 120 órán át 35°C hőmérsékleten, anaerob körülmények között inkubáljuk a tenyészeteket, majd vizsgáljuk az 500 p.g' /ml kanamicin B jelenlétében növekedni képes telepeket. 25 A plOll plazmid kanamicin és kloramfenikol rezisztenciát meghatározó géneket hordoz, tartalmaz továbbá E. coli sejtekben replikációt megengedő replikációs origót. Más baktériumba transzformálva, mivel nem rendelkezik 30 megfelelő replikációs origóval, a plazmid DNS vagy eliminálódik, vagy pedig részben vagy egészben beépül a kromoszómába, genetikai rekombináció történik. A kromoszómába beépült gén szerencsés esetben kifejeződik és 35 kanamicin (illetve kloramfenikol) rezisztenciát biztosít. Kísérletünkben kaptunk kanamicin B-re rezisztens telepeket, a transzformációs frekvencia: 3xl0'5. 40 Néhány rezisztens telepet izoláltunk és meghatároztuk a kiindulási és a kanamicin B-re rezisztens (Km*) törzsek antibiotikum érzékenységét. Néhány törzzsel kapott eredményt az 1. táblázatban adunk meg. 45 1. táblázat A bendőbaktériumok és a genetikailag jelzett, szénát bontó törzsek kanamicin B érzékenysége 55 60 65 Mikroorganizmus Bendőtartalom Legkisebb növekedésgátló konc. Kanamicin B Eg/ ml 31 Kiindulási törzsek 4,0 — 7,5 Genetikailag jelzett, Km* törzsek Hh-GYOKI-1-8 500-27 250-91 500-123 1000-142 500 így olyan, bendőből származó, szénát vagy cellulózt hasznosítani képes mikroorganizmusokhoz jutunk, amelyek jelentős mennvi-
