193283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4-dezacetil-indol-dihidroindol alkaloidok bifunkciós észter-származékainak előállítására

hez. A vegyülat. fizikai állandói a következők: IR-spektrum vmax (cm"1):

3450, 1738, 1820.

NMR-spektrum (CDC13) ô (ppm):

8,05, 7,45, 7,15, 6,40, 6,10, 5,88, 5,42, 5,37, 4,00, 3,81, 3,76, 3,65, 2,74, 0,95.

350 pl 14,7 mg/m! koncentrációjú dimetil-formamidos aktivált VLB-4-hemiszukcinát-oldatot gyors keverés közben 2,0 ml 20,0 mg/ml koncentrációjú 0,34 mól/l-es borát-pufferrel (pH 8,6) készült kis sejtes tüdőkarcinoma elleni egér monoklonális ellenanyag-oldathoz adunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük, majd pH-ját 1 n hidrogén-klorid-oldattal 7,4-re állítjuk és centrifugáljuk. A terméket 2,0 x 22,0 cm-es (67,0 ml), foszfát-pufferes sóoldattal ekvilibrált Bio-Gel P-6 oszlopon gélszűréssel tisztítjuk. A kizárt csúcsot (9,7 ml) összegyűjtjük, majd 270 és 280 nm-en spektrometriásan mérjük a dezacetil-vinblasztin és protein tartalmat. A fenti módon előállított konjugátum 7,5 mól VLB-t tartalmaz 1 mól Ig-re számítva.

Az aktíváit VLB-4-hemiszukcinátot — amelyben 1 -szukcinimid-oxi-csoport az aktiváló csoport — az alábbi tökéletesített eljárással is előállíthatjuk.

1 g VLB-4-hemiszukcinátot 380 mg N-metil-morfolinnal elegyítünk 20 ml metilén-kloridban, és hozzáadunk 390 mg izobutil-klór-formiátot. A reakcióelegyet 0°C körüli hőmérsékleten nitrogénatmoszférában kb. 45 percen át keverjük. Hozzáadunk 795 mg N-hidroxi-szukcinimidet, majd a reakcióelegyet nitrogénatmoszférában 45 percen át visszafolyató hűtő alatt forraljuk. A reakcióelegyet lehűtjük, és ionmentes vízzel mossuk, majd nátrium-szulfát felett azonnal megszárítjuk. A szárítóanya' got szűréssel elválasztjuk, és a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. 900 mg maradékot kapunk, amely vékonyréteg-kromatográfiás meghatározás szerint > 90% tisztaságú.

400 mg VLB-4-hemiglutarátot metilén-kloridos oldatban az eredeti eljárás szerint egymást követően N-metil-morfolinnal, izobutil-klór-formiáttal és N-hidroxi-szukcinimiddel kezelve 160 mg 4-[4-(l-szukcinímid-oxi-karbonil) ] - buti ri 1-VLB-1 kapunk.

540 mg 4’-épidezoxi-VLB-4-hemiszukcinátból a fenti eljárás szerint 360 mg 4- [3-(l-szukcinimid-oxi-karbonil) ] -propionil-VLB-t kapunk. A termék vékonyréteg-kromatográfiás R/ értéke (szilikagél, 1:1 arányú etil-acetát-metanol elegy) 0,23.

A fenti eljárás szerint állítunk elő aktivált vindezin-4-hemiszukcinátot (más néven 4- [3-(l-szukcinimid-oxi-karbonil)j -propionil-vindezint) is. A termék fizikai állandói: IR-spektrum vmax (cm'1):

3520, 347Q, 3400, 1810, 1791, 1744, 1744 és 1650 között széles váll;

NMR-spektrum (CDC13) ő (ppm):

8,08, 7,45, 7,15, 6,44, 6,12, 5,85, 5,48, 5,32, 3,79. 3,64, 3,58, 2,85, 2,84, 0,95, 0,78.

i

11

256 mg megfelelő kiindulási anyagból 140 mg 4- [3-( 1 -szukcinimid-oxi-karbonil)]-propionil-vinkrisztint állítunk elő.

IR-spektrum vmax (cm'1): 3460, 1810, 1785, 1744, 1718 és 1683.

NMR-spektrum (CDC13) <5 (ppm):

8,79, 8,19, 8,14, 7,78, 7,41, 7,18, 6,97, 6,84, 5,92, 5,42, 5,35, 4,72, 4,52, 3,81, 3,78, 3,71, 2,85, 0,83.

3. példa

JWetíl-VLB-4-hemiszukcinát előállítása

200 mg VLB-4-hemiszukcinátot 10 ml ecetsavanhidridben oldunk. Hozzáadunk 5 ml jégecetet, majd 200 ml 5 csepp piridínt tartalmazó metanolt. Az oldatot fél órán át híítjük, majd szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, és 16 órán át a fenti hőmérsékleten tartjuk. Az illékony komponensek elpárologtatása után olajos maradékot kapunk. A maradékot vízben oldjuk, és a vizes oldatot 14 n vizes ammónium-hidroxid-oldattal meglúgosítjuk. A bázikus vizes fázist metilén-kloriddal extraháljuk. A metilén-kloridos extraktűmokat vízzel mossuk és szárítjuk. Az oldószer eltávolítása után maradékként VLB-4-szukcinát-metil-észtert,’más néven 4-(3.-metoxi-karbonil)-propionil-VLB-t kapunk.

A metil-félésztert az alábbi tökéletesített eljárás szerint is előállíthatjuk.

1020 mg'VLB-4-hemiszukcinátot — melyet a 2. példában leírt módon N-hidroxi-szukcinimiddel aktiváltunk — 25 ml metanolban oldunk. A reakcióedényt nitrogénatmoszférában lezárjuk és fénytől is védjük. 18 óra elteltével az illékony komponenseket vákuumban eltávolítjuk. A maradékot szilikagéllel töltött nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon kromatografáljuk, az eluálást etil-acetátból és 1:1 arányú etil-acetát-metanol elegyből kialakított grádienssel végezzük. A vékonyréteg-kromatográfiás meghatározás szerint kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük. Az illékony komponenseket vákuumban eltávolítva sárgásbarna amorf por formájában 310 mg metil-4-hemiszukcinát-VLB-t kapunk. A szabad bázisból a szulfát-sót a szokásos módon állítjuk elő (2% kénsavat tartalmazó 2BetOH).

A fenti eljárással állítjuk elő az alábbi metil-észtereket is: Metil-vindezin-4-hemiszukcinát

R/ (szilikagél, 1.1 arányú etil-acetát-metanol) = 0,5

IR-spektrum vmax (cm-1):

1735, 1699 Tömeg-spektrum:

867 (M+), 836 (M-31), 808 (M-59) NMR-spektrum (CDC13) ő (ppm):

9,94, 8,05, 7,52, 7,14, 6,98, 6,58, 6,12, 5,87, 5,53, 5,30, 3,79, 3,69, 3,62, 3,47, 2,74. 0.90, 0,81.

Metil-4’-epidezoxi-VLB-4-szukcinát-szulfát-só: R, (szilikagél, 1:1 arányú etil-acetát-metanol) = 0,55;

12

193283

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7