193266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-glaktozidázt termelő, de invertázt nem termelő mikroorganizmus előállítására
-húslevesbe visszük át és a tenyészetet 45 percen át 37°C-on rázatjuk, mimellett teljessé válik a transzformációs reakció. A sejteket kinyerjük, mossuk és ismét szuszpendáljuk. A sejt-szuszpenzió egy hányadát agar-lemezre szélesztjük, amely a következő összetételű /I literre vonatkoztatva/: 10,5 g K2HP04, 4,5 g KH2P04, 1 g /NH4/2S04, 0,5 g nátrium-citrát. 2HsO, 0,1 g MgS04. 7H20, 1 mg tiamin, 2 g raffinóz, 25 mg ampicillin és 15 g agar /a pH-t 7,2-re állítjuk be/. A lemezt 37°C-on inkubáljuk. 2 napos tenyésztés után számos telep jelenik' meg a lemezen. Több telepet kiválasztunk, tisztítunk és elkülönítünk. Minden így kapott telep képesnek mutatkozik arra, hogy egyedüli szén-forrásként raffinózt hasznosítson, és egyidejűleg ampicillin-rezisztens. Tehát más tulajdonságokkal rendelkezik, mint az a mikroorganizmus-törzs, amelyből előállítottuk. Ez azt jelenti, hogy növekedő telepek formájában sikerült szelektálnunk az olyan pBR 322 plazmidot tartalmazó sejteket, amelyekbe beiktattuk az alfa-galaktozidáz gént hordozó Pl raf-ból kapott Sal I. fragmentumot. Az így kapott telepekből a /2/ pont szerinti eljárással elkülönítjük a plazmid-DNS-t. A plazmidok, mint minden telep, Eco R 1. vagy Hind Ili. restrikciós endonukleázzal végzett kezelés után, agaróz gélben végzett elektroforézissel, két fragmentumot mutatnak, amelyek a hibrid-plazmid eredete függvényében két különböző nagyságrendbe sorolhatók, végeredményben azonban azonosak. A két nagyságrend kb. 1:1 arányban fordul elő. A két fragmentum-nagyságrendre vonatkozó elemzési eredmények eltérése a Pl raf-ból /a pBR 322-ben/ származó Sal I. fragmentum eltérő integrációs irányára vezethető vissza. A plazmiddal végzett további munkához egy olyan telepet választunk ki, amelynek plaz-midja Eco R I. vagy Hind III. restrikciós enzimmel végzett kezelés után kisebb második fragmentumot szolgáltat, mint más telepekből kapott plazmidok. Ezt a plazmidot pBT 100-nak /BMTU 2741 / nevezzük /DSM 2090/. Azok a baktériumok, amelyek ezt a plazmidot tartalmazzák, képesek raffinózt mint egyedüli szén-forrást hasznosítani és konstitutive termelik a raf operon valamennyi enzimjét. /5/ A pBT 100 plazmid DNS-éből 10 pg-t vagy a Hind III. restrikciós endonukleázzal, vagy az Eco R I. restrikciós endonukleázzal kezelünk 37°C-on, 1 órán át, a DNS molekula elbontására. Az elegyet ezután 5 percen át 65°G- on tartjuk. Az így kezelt plazmid-DNS oldatokat hígítjuk és a /3/ pontban ismertetett módon T4 ligázzal renaturáló kezelésnek vetjük alá. Végül a /4/ pontban leírt módon az E. coli törzs kompetens sejtéihez hozzáadjuk a transzformációs reakció végső lépéséből származó renaturált DNS oldatokat. Az így kezelt -sejtek egy kis hányadát Mac Conkey raffinóz lemezre /Difco Laboratories, Detroit/ széleszt- 6 9 jük, amely 25 pg/ml ampicillint tartalmaz. Az előzőleg Hind Ili.-mal kezelt plazmid-DNS transzformációjának megfelelő lemezen 37°C- on 24 órán át végzett tenyésztés után kb. 20 telep figyelhető meg; az előzetesen Eco R I.-gyel kezelt DNS transzformációjának megfelelő lemezen ugyanilyen körülmények között kb. 30 telep található. A vörös és fehér telepek aránya az első esetben 1:4, a másodikban 1:3. A vörös telepek egyöntetűen képesek raffinóz lebontására, tehát még mindig tartalmazzák a teljes raf operont, a fehér sejtek közül azonban nem mindegyik képes a raffinóz lebontására. Ezek azonban még mindig konstitutive termelik az alfa-galaktozidáz enzimet. Erre mutat a sejtmentes kivonatban szín-szubsztrátként p-nítrofenil-alfa-galaktoziddal /a 1- fa-PNPG/ végzett kísérlet, ha a sejteket előzetesen raffinózt nem tartalmazó táp-húsleves ben 37°C-on a stacionárius fázisig tenyésztjük. Ezek a sejtek tehát más tulajdonságokkal rendelkeznek, mint a kiindulási organizmus vagy a BMTU 2741 /DSM 2090/ sejtek, amelyeket pBT 100-zal transzformáltunk. Azt a plazmidot, amely a pBT 100 előzetesen Hind III.-mal végzett kezelése után a Mac Conkey lemezeken megjelenő fehér telepekben található, pBT 101-nek nevezzük, az előzetesen Eco R L-gyel végbemenő reakció után kapott plazmidot pedig pBT. 102-vel jelöljük. A pBT 102-t tartalmazó E. coli törzset BMTU 2742 /DSM 2091/ jelöléssel látjuk el. /6/ Alfa-galaktozidáz előállítása pBT 102-t tartalmazó BMTU 2742 törzsekből. Az 1. táblázat mutatja be a sejtmentes kivonat alfa-galaktozidáz tartalmának meghatározására alfa-PNPG-vel végzett vizsgálat kísérleti eredményeit a BMTU 2742 törzs tenyésztése után, amely törzs az /5/ lépésben kapott egyik kiónt képviseli. A sejteket 10 ml táp-húslevesbe oltjuk be, 100 ml-es lombikokban és 15 órán át rázatjuk 30°C-on. A kontroll-kísérleteket úgy végezzük, hogy a BMTU 2743 kiindulási törzset azonos körülmények között tenyésztjük, de a táptalajhoz 0,2% raffinózt adunk. Mint az 1. táblázatból látható, a BMTU 2742 törzs kivonatai jóval magasabb alfa-galaktozidáz tartalmat mutatnak, mint a BMTU 2743 törzs kivonatai. 1. táblázat A törzs száma Alfa-galaktozidáz, E/mg BMTU 2742 /DSM 2091/ 10 BMTU 2743 /DSM 2092/ 0,4-Rmg oldható fehérje a nyers kivonatban Ilyen kísérleti körülmények között az ismert E. coli BMTU 2744 törzs 0,001 E/mg-nál kisebb aktivitást mutat. 2. példa Az 1. példa /1 / pontjában leírt módon E. coli BMTU 2481 /DSM 2101/ törzsből fágokat különítünk el és ezeket az 1. példa /3/ pontjában leírt módon Eco R I.-gyel elbontjuk. Az 10 193266 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
