193266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-glaktozidázt termelő, de invertázt nem termelő mikroorganizmus előállítására
193266 így kapott készítmény DNS-forrásként szolgál, amely tartalmazza az alfa-galaktozidázra vonatkozó genetikai információt. A DNS vektor előállítására az E. coli BMTU 2745 /DSM 2100/ törzsből az 1. példa /2/ pontja szerint előállítjuk a pKT 230 plazmid DNS-jét, a sejtek tenyésztését /37°C-on, egy éjjelen át, levegőztetés mellett/ olyan táp-húslevesben végezzük, amely nem tartalmaz kloramfenikolt. A kapott plazmid DNS-t az /1 / példa /3/ részében megadott módon Eco R I.-gyel elbontjuk. A 4. megadalton nagyságú fág-fragmentum elkülönítését és az elbontott pKT 230 DNS-sel való összekapcsolását ugyancsak az 1. példa /3/ pontjában leírt módon végezzük. Az így kapott rekombináns DNS oldatot az 1. példa /4/ pontjában leírt módon E. coli BMTU 2602 /DSM 2102/ transzformálására használjuk fel. A szelekciót olyan agar-lemezen végezzük, amely 25 pg/ml kanamicint tartalmaz. Mintegy 40, kanamicinnel szemben rezisztens telepet kapunk, majd megvizsgáljuk ezek streptomicin-érzékenységét /50 pg/ /ml/. Kb. 20 streptomicin-érzékeny telepet találunk, melyek azonban még 20 pg streptomicinnel szemben is rezisztensek. Mint az 1. példában leírtuk, az elkülönített telepekben alfa-galaktozidáz képződése mutatható ki. Az így kapott új E. coli BMTU 2746 /DSM 2103/ törzs azonban, amely a kanamicin-rezisztencia, kismértékű streptomicin-rezisztencia és az alfa-galaktozidáz termelés tekintetében különbözik a BMTU 2602 /DSM 2102/ kiindulási törzstől, egyebekben az utóbbinak felel meg. Ezen új törzs sejtjei a pBT 103 plazmidot tartalmazzák, amely alfa-galaktozidáz gént hordoz, mint ez a keletkezett alfa-galaktozidáz kimutatásával igazolható. Annak érdekében, hogy a pBT 103-t a BMTU 2746 /DSM 2103/-ból Pseudomonas putida BMTU 2749 /DSM 2106/-ra vigyük át, mindenekelőtt összekeverjük a BMTU 2746 /DSM 2103/ és a BM TU 2747 /DSM 2104/ növekedő baktérium-tö. ,.s logaritmikus fázisú sejtjeit /az utóbbi tartalmazza az átvihető RP4 plazmidot/ és Standard II. agar-lemezre /Merck, Darmstadt/ szélesztjük amely 20 pg/ /ml streptomicint és 20 pg/ml tetraciklint tartalmaz. 37°C-on végzett tenyésztés során kb. 50 telep nő ki, ezek közül egyet elkülönítünk. A megfelelő antibiotikum-tartalmú lemezeken végzett szélesztéssel kimutatható, hogy ez az új BMTU 2748 /DSM 2105/ törzs rezisztens 20 pg/ml streptomicinnel, 26 pg/ml kanamicinnel, 20 pg/ml tetraciklinnel és 50 pg/ml ampicillinnel szemben. Ez a törzs tartalmazza az RP 4 és pBT 103 plazmidot, ami a keletkezett alfa-galaktozidáz kimutatásával igazolható. A pBT 103 plazmid átvitelét a BMTU 2748 /DSM 2105/-ből a Pseudomonas putida BMTU 2749 /DSM 2106/-ra úgy végezzük, hogy a két törzs logaritmikus fázisban lévő 11 növekvő tenyészeteit összekeverjük, és a keveréket Standard II. agar-lemezen /Merck, Darmstadt/ 30°C-on 24 órán át tenyésztjük, majd a sejteket steril táp-húslevessel lemossuk és szelektív táp húsleves agar lemezekre— Standard II.—szélesztjük, amely 100 pg/ml kanamicint és 25 pg/ml kloramfenikolt tartalmaz. Két nap alatt kb. 20 telep nő ki, amelyeket megtisztítunk és az alfa-galaktozidáz gént hordozó pBT 103 plazmidot tartalmazó Pseudomonas putida BMTU 2750 /DSM 2107/ként azonosítunk. Az alfa-galaktozidáz kimutatását az 1. példában leírt módon végezzük. 3. példa Raffinóz elbontása a kristályosítási folyamat alatt egy cukorgyárban. 45 ml kristályosítási elfolyót, amely 802 mg raffinózt tartalmaz, 45 ml vízzel hígítunk. Az oldat pH-értékét 6,5-re állítjuk be. Ezt az oldatot párhuzamos kísérletekben a találmány szerinti E. coli DSM 2091 törzs sejtmentes kivonatával, illetve toluollal kezelt sejtjeivel inkubáljuk, mimellett a kivonat ill. a kezelt sejtek 57-57 egység alfa-galaktozidázt tartalmaznak. A keveréket 60, 120 és 180 percen át 40°C- on tartjuk. Ezen idők eltelte után enzimesen meghatározzuk az oldat galaktóz-tartalmát és kiszámítjuk a raffinóz fennmaradó mennyiségét. Azt találjuk, hogy a megadott kezelési idők után a raffinóz fennmaradó mennyisége 459, 378 és 315 mg, ami az eredeti raffinóz-tartalom 57,2, 47,1 és 39,2%-ára való csökkenésnek felel meg. A kapott eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze. 2. táblázat 90 ml kristályosítási elfolyót, amely 802 mg raffinózt tartalmaz, 40°C-on és pH 6,5-en 57 E alfa-galaktozidázzal kezelünk Kezelési idő Raffinóz-tartalom A kiindulási 12 perc mg ért 0 802 100,0 60 459 57,2 120 378 47,1 180 315 39,2 4.a példa pBR 327 és pHP 34 vektorok hordozó plazmidként való felhasználása a-galaktozidáz gén számára. Az 1. példában leírt módon járunk el, azonban az 1.2 lépésben a pBR 322 plazmid helyett pBR 327, illetve pHP 34 plazmidot alkalmazunk (Gene, 9., (1980.) 287-305., Gene, 17., (1982.) 189-196.). Az említett plazmidokat tartalmazó E. coli törzseket az 1.2 példákon leírt módon tenyésztjük és a plazmidokat elkülönítjük. A raf-operont az 1.3 példában leírt módon visszük be a vektorba és a további feldolgozást szintén az 1. példában leírt módon végezzük. 4.b példa Alfa-galaktozidáz expressziója Bacillus subtilis-ben a pUB 110 plazmiddal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
