193266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-glaktozidázt termelő, de invertázt nem termelő mikroorganizmus előállítására
A mikroorganizmusoknak a találmány szerinti eljárásban alkalmazható transzformálható alakját, az u.n. kompetens törzseket a szakember számára ismert módon kapjuk meg. A tenyésztést célszerűen az exponenciális növekedési fázis végéig folytatjuk. A sejteket ezután elkülönítjük és jéghideg kalciumklorid oldatban szuszpendáljuk. Ebben a formában képesek DNS felvételére. E. coli alkalmazása esetén tenyésztő táptalajként előnyösen az u.n. standard II. táp-húslevest /Merck, Darmstadt, NSZK/ alkalmazzuk. A találmány szerint eljárást hoztunk létre mikroorganizmusok előállítására, amelyek igen nagy mennyiségben képezik az alía-galaktozidáz enzimet anélkül, hogy ennek során egyidejűleg invertázt képeznének. Ilymódon alfa-galaktozidáz forrást bocsátunk rendelkezésre, amely sokkal kedvezőbben alkalmazható raffinóz vagy más, alfa-galaktozid kötéseket tartalmazó cukrok elbontására, pl. a répacukorból kiinduló cukorgyártásban a cukor kristályosítása során, mint az eddig ismert alfa-galaktozidáz készítmények. Ennek következtében lehetővé válik a raífinóz-dúsítás nagyüzemi problémájának gazdaságos megoldása a cukorrépából kiinduló gyártás során. A találmány szerinti mikroorganizmus vagy az abból előállított, nyers vagy tisztított alfa-galaktozidáz készítmények azonban az élelmiszerkémiai technológia más területein is alkalmazhatók, amelyeken alfa-galaktozid kötéseket tartalmazó szénhidrátok elbontása a cél. Példa erre a sztachióz eltávolítása szójalisztből. Erre az eltávolításra szükség van, ha a szójalisztet élelmiszergyártási célokra kell alkalmaznunk. A találmány további szemléltetésére a következő példákat mutatjuk be. 1. példa Az alfa-galaktozidáz génként Pl raf-ot tartalmazó DNS-t hordozó Escherichia coli BMTU 2743, (DSM 2092) törzsből magas alfa-galaktozidáz termelő képességű uj törzseket állítunk elő, a következő eljárási lépések segítségével: /1 / Pl raf DNS előállítása — amely a raf-operon számára szolgáló genetikai információt tartalmazza — Pl raf lizátumból. Az E. coli BMTU 2743 (DSM 2092) törzset /thr- leu-, thi-, lacY, tonA, raf'1', Plts-lizogén/, amely az E. coli K-12, BMTU 2744, (DSM 2093) törzsből vezethető le, 4 órán át, 30°C-on, egy liter táp-húslevesben való rázatás mellett tenyésztjük - amely 1% triptont, 0,5% élesztőkivonatot, 0,2% glükózt és 0,5% NaCl-t tartalmaz, és amelyet pH 7,8-re állítunk be—, és 0,5 OD650 optikai sűrűség elérése után /650 nm-en mérve/ 40°C-on 2-órán át tovább rázatjuk a hőmérsékletérzékeny fág-represzszor hő-indukciója céljából. A felülúszóból polietilénglikollal végzett kicsapással kinyerjük a szabaddá vált fágokat és ezeket cézium-klorid-sűrűség-gradiensben tisztítjuk. Fenolos 7 extrakció és pufferrel /10 mM trisz. HCL, pH 8,0/ szemben végzett dialízis után 0,6 mg tisztított fág-DNS-t kapunk. /2/ A vektor-DNS előállítása A Pl raf DNS-fragmentum klónozásához a pBR 322 plazmid DNS-jét alkalmazzuk, vagy is egy olyan vektort, amely markerként ampi Ciliin- és tetraciklin-rezisztencia géneket tartalmaz. Vagy a kereskedelemben kapható plazmidot alkalmazzuk, vagy azt a következőképpen állítjuk elő: A BMTU 2602 (DSM 2102) E. coli törzset, amely a pBR 322 plazmidot tartalmazza, 37°C-on 1 liter táp-húslevesben - amelynek összetétele megegyezik az /I/ pont szerintivelrázatás közben az exponenciális növekedési fázis végéig tenyésztjük. Ezután 150 pg/ml kloramfenikol hozzáadása után 15 órán át ugyanezen a hőmérsékleten folytatjuk a rázatást. Ezen eljárás segítségével a plazmid-DNS-t kitüntetett módon szaporítjuk és a baktériumokban feldúsítjuk. Végül kinyerjük a baktérium-sejteket, lizozimmel és egy nemionos detergenssei Ifzist hajtunk végre, és a lizátumot 30 percen át 48000 g-vel centrifugáljuk a felülúszó folyadék elkülönítésére. Ebből, cézium-klorid-etidiumbromid egyensúlyi sűrűség-gradiensben végzett kétszeri eentriíugálás, majd fenolos extrakció és dialízis segítségével - 10 mmól/1 trisz.HC1, pH 8,0 pufferrel szemben - 420 pg plazmid-DNS-t kapunk. /3/ A Pl raf-ból származó raf-operon bevitele a vektorba 10-10 pg RÍ raf DNS-t és vektor DNS-t 37°C-on 1 órán át Sal I. restrikciós endonukleázzal kezelünk, a DNS molekula teljes elbontására, majd 5 percen át 65°C-on tartjuk az elegyet. Ezután a Pl raf DNS-t 0.7%-os agaróz-gélben elektroforézissel frakcionáljuk. A 4 megadalton relatív molekulasúlyú fragmentumot kivágjuk és fenolos extrakció, majd pufferrel- 10 mM trisz.HC1, pH 8,0—szemben végzett dialízis után oldatban tartjuk. A Pl raf DNS így kapott fragmentumának oldatát összekeverjük a pBR 322 vektor DNS elbontásával kapott oldattal és az elegyet ATP ditioeritrit és magnéziumklorid hozzáadása után 24 órán át 4°C-on a T4 fág DNS-ligáza hatásának tesszük ki. Az így előállított oldat tartalmazza a rekombináns DNS-t. /4./ E. coli baktériumok genetikai transzformációja rekombináns DNS-sel, amely az alía-galaktozidázra vonatkozó genetikai információt tartalmazza. Egy közönséges E. coli törzset /BMTU 2744, DSM 2093/ rázatás mellett, 50 ml táp-húslevesben 37°C-on az exponenciális növekedési fázis végéig tenyésztünk. A sejteket kinyerjük és 50 mmól/1 CaCI2 oldatban, jégfűrdőben szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót összekeverjük a rekombináns DNS-nek a /3/ lépésből származó oldatával és 20 percen át jégfűrdőben tartjuk, majd 3 percen át 37°C-on inkubáljuk. A sejteket táp-8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
