193266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-glaktozidázt termelő, de invertázt nem termelő mikroorganizmus előállítására
A találmány tárgya eljárás egy - kofaktorokat nem igénylő - alfa-galaktozidázt termelő, invertázt azonban nem képező mikroorganizmus, valamint annak felhasználásával alfa-galaktozidáz előállítására. A cukorrépából nyert kivonatok az elsősorban előforduló cukor-komponens, a szachcharóz mellett kismennyiségü raffinózt, egy triszaccharidot tartalmaznak, amely a galaktóz, glukóz és fruktóz monoszaccharidokból áll. Ez a raffinóz azt a kedvezőtlen tulajdonságot mutatja, hogy a kristályosítás során a felülűszókban feldúsul,és ha mennyisége meghaladja az össz-cukormenny'iség kb. 1 %-át, nehezíti, illetőleg bizonyos eljárások esetében gátolja annak kristályosodását. Egy kb. 3 hónapos kampány alatt egyetlen cukorgyárban naponta 5-10 t raffinóz kerül a kristályosítási Felülűszóba. Egyedül az NSZK-ban naponta 200 t-nál több raffinóz kiválása tételezhető fel. Ennek a raffinóznak szaccharózzá való átalakítása jelentős gazdasági tényező, amely mindeddig nem vagy nem kielégítő mértékben érvényesült, mivel nem álltak rendelkezésre a kívánt pontosságú megfelelő technológiák. Pontosságon itt a galaktóznak a raffinóz-molekulából való szelektív lehasítását kell értenünk, az alkalmazott reagens által tovább nem hasítható vagy bontható szaccharóz keletkezése mellett. Ez azonban mindeddig sem kémiai, sem enzimes úton nem volt lehetséges. Ismeretesek enzimes eljárások, amelyek során egy, a természetben előforduló enzimet, az alfa-galaktozidázt alkalmazzuk. Ez az enzim per deíinitionem kvantitatíve lehasítja a galaktózt a raffinóz-molekulából. Minden eddig ismert alía-galaktozidáz készítmény azonban egy enzimmel, az invertázzal szennyezett, amely a szaccharózt glukózzá és fruktózzá bontja le. Figyelembevéve a szaccharóz magas koncentrációját a jelenlevő raffinózhoz képest / kb. 60-80:1 / az alfa-galaktozidáz kismértékű, invertázzal való szennyezettsége is nagyon zavaró, mivel jelentős szaccharóz-mennyiséget tovább bont és ílymódon csak az érhető el, hogy egy zavaró szennyezést egy másikkal cserélünk fel. Ezek az eljárások ezért alig voltak a gyakorlatba bevezethetők. Itt kell megemlítenünk, hogy az ismert, invertázzal szennyezett alfa-galaktozidázok közül, amelyeket eddig a technológiákban alkalmaztak, mindenekelőtt a gomba-eredetű enzimek azok, amelyek hozzáférhetőségük folytán a cukor-technológiákban felhasználásra kerültek. Ezek alkalmazásával, az említett szennyezésen kívül az a hátrány is együttjár, hogy ezek, mint gomba-eredetű enzimek az erősen savas pH-tartományban mutatnak aktivitás-maximumot, ami nagyvolumenű / gyúrónként több, mint 100 m3/óra/ technológiák esetében jelentős problémákat vet fel a megsavanyítás és a semlegesítés kapcsán. Egyetlen alfa-galaktozidáz ismert, amely tisztítás után invertáz-mentes. Ez az alfa-ga-1 2 laktozidáz azonban kofaktorként mangán-ionokat és NAD-t igényel, ezenkívül stabilitása alacsony és csak kis koncentrációban fordul elő biomasszában. Ezért ez az alfa-galaktozidáz a folyamatos cukorgyártás körülményei között az eljárás során nem vehető figyelembe. A találmány tehát annak a feladatnak a megoldására irányul, hogy alfa-galaktozidázt állítsunk elő, amely természetesen teljesen invertáz-mentes. Egyidejűleg az enzimnek még a következő tulajdonságokkal kell rendelkeznie: A semleges ponthoz igen közel kell maximális aktivitását kifejtenie; bizonyos hőmérséklet-stabilitást kell mutatnia; aktivitását hosszabb időn át meg kell őriznie aránylag tömény cukor-oldatokban, ill. növényi kivonat / cukorrépa-kivonat/ koncentrátumokban; nem igényelhet kofaktorokat. Ennek a feladatnak a megoldására a találmány abból indul ki, hogy a DNS-rekombináció alkalmazásával feltehetően lehetségessé válik egyrészt az alfa-galaktozidázzal rendszerint együttjáró invertáz enzim irreverzibilis eltávolítása - az invertázt kódoló gén-szakasz kiiktatása révén -, másrészt az alfa-galaktozidáz kódolásáért felelős gén-szakasz vektor alakjában való kiterjesztése és ennek eredményeként, a magas gén-dózis hatás fellépése és a reguláció megváltoztatása következtében a kívánt enzim invertáz-mentesen, a lehetséges maximális koncentrációban állítható elő. Ideális esetben maga a nyers baktérium-kivonat, vagy egy immobilizált kivonat lenne alkalmazható. Ennek előfeltétele egy megfelelő eljárás kidolgozása, egy megfelelő operon és egy alkalmas restrikciós endonukleáz rendelkezésre bocsátása. A találmány szerint ezt a feladatot egy olyan mikroorganizmus előállítására irányuló eljárás segítségével oldjuk meg, amely kofaktorokat nem igénylő alfa-galaktozidázt termel és invertázt nem képez. Az eljárás azzal jellemezhető, hogy egy alfa-galaktozidáz gént tartalmazó DNS-t és egy, az alkalmazásra kerülő transzformálható sejtek számára megfelelő vektort - amely antibiotikumokra rezisztens géneket tartalmaz - Sal I / EC 3.1.23.37/ restrikciós endonukleázzal teljesen elbontunk, az alfa-galaktozidáz gént tartalmazó DNS fragmentumaiból egyet - amelynek relatív molekulasúlya kb. 4 megadalton - izolálunk, átvisszük a Sál I.-gyel elbontott vektor oldatába és DNS-ligáz jelenlétében rekombináljuk, rekombináns DNS keletkezése mellett, a kapott rekombináns DNS-t a transzformálható sejtekkel inkubáljuk, a transzformált sejteket egyedüli szénforrásként raffinózt tartalmazó táptalajon szélesztjük, a képződött antibiotikum-rezisztens telepeket elkülönítjük és lízisnek vetjük alá, a lizátumból elkülönítjük a plazmid-DNS-t, ezt Hind III. / EC 3.1.23.31/ vagy Eco RI / EC 3.1.23.13/ restrikciós endonukleázzal elbontjuk, a kapott oldatot hígítjuk és DNS-Iigázzal kezeljük, a kapott renaturált 2 193266 5 10 15 20 25 30 3b 40 45 50 55 60 65
