193266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-glaktozidázt termelő, de invertázt nem termelő mikroorganizmus előállítására
193266 plazmidot ismét bevisszük transzformálható sejtekbe, a transzformált sejteket ismét szélesztjük egy szénforrásként raffinózt, valamint antibiotikumot tartalmazó táptalajon és elkülönítjük a kifejlődött, raffinózt nem hasznosító telepeket. Egy alfa-galaktozidáz gént tartalmazó DNS-t előnyösen E. coli BMTU 2743, DSM 2092 tenyészetből nyerünk ki olymódon, hogy a mikroorganizmust megfelelő táptalajon, magasabb hőmérsékleten - előnyösen 37-42°C- on - tenyésztjük, a DNS-t polietilénglikollal kicsapjuk és pl. sürűség-grádiens és fenolos extrakció alkalmazásával tisztítjuk. Mind az alfa-galaktozidáz gént tartalmazó DNS, mind a vektor-DNS hasítását önmagában ismert módon végezzük, Sal I. restrikciós endonukleáz alkalmazásával, célszerűen 35-37°C közötti hőmérsékleten, amíg a DNS molekula elbontása teljessé nem válik. Végül az endonukleázt, célszerűen hevítéssel, denaturáljuk. Az alfa-galaktozidáz gént tartalmazó DNS fragmentumait gél-elektroforézissel frakciónáljuk és elkülönítjük a kb. 4 megadalton relatív molekulasúlyú fragmentumot. Ennek a fragmentumnak az elbontott vektorral való rekombinálása úgy történik, hogy egyszerűen összekeverjük az oldatokat és az elegyhez hozzáadunk egy megfelelő DNS-Iigázt. Előnyösen a T4 fág DNS-ligázát / EC 6.- 5.1.1/ alkalmazzuk, de más eredetű DNS-ligázok is megfelelnek. így a rekombinált DNS-hez jutunk, amelyet a szokásos módon összekeverünk transzformálható sejtekkel / u.n. kompetens törzsekkel, amelyek képesek a DNS felvételére/ . Ennek során végbemegy a transzformációs reakció. A találmány keretében transzformálható sejtekként azokat alkalmazzuk, amelyek ilyen tulajdonságuk révén ismertté váltak. Példaként a megfelelő transzformálható sejtekre a következőket említjük meg: E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae és Bacillus subtilis. Különösen előnyösen alkalmazható az E. coli, pl. a BMTU 2744 DSM 2093 törzs. Mindez különösen a találmány szerinti eljárás keretében az első transzformációs lépésben érvényes. A találmány szerinti eljárás második transzformációs lépése esetében a transzformálható sejtek kiválasztása e sejtek egyéb tulajdonságai figyelembevételével történik, amilyen a sejt-komponenseknek az alfa-galaktozidáz előállítása utáni felhasználhatósága, a növekedési tulajdonságok és a hozzáférhetőség. A második transzformáció céljaira különösen előnyös ugyancsak az E. coli és a Pseudomonas putida. A vektor kiválasztása függ a transzformálható sejtek minőségétől. Ha transzformálható sejtekként E. coli törzseket választunk ki, vektorként előnyösen a pBR 322 /DSM 2089/ plazmidot alkalmazzuk, amely a kereskede3 lemben hozzáférhető / Nucl. Acid. Res. 1978, 5, 2721-2728/ . Saccharomyces sejtek esetében vektorként megfelelően alkalmazható pl. a pFLl plazmid, amelyet Mercereau és társai írnak le / Gene, 11. kötet, 163-167, 1980/. Bacillus subtilis sejtek esetében vektorként különösen a pHV23 plazmid felel meg, amelyet B. Michel és társai / Gene, 12. kötet, 147-154, 1980/ írnak le. Minden egyéb fentemlített mikroorganizmus, valamint az E. coli esetében megfelel a pRSF 1010 is. Ugyanez érvényes a pRT 230 tekintetében /mindkettőt leírja a „Microbial Degradation of Kenobiotics and Recalcitrant Compouds" c. könyv; kiadó Hütter és Leisinger, Acad. Press, 1981., London/. A figyelembe vehető transzformálható sejtek közül azokat kell előnyben részesítenünk, amelyek nem tartalmaznak plazmidokat. Ilyen pl. a fentemlített E. coli BMTU 2744 (DSM 2093). A találmány szempontjából lényeges egy alfa-galaktozidáz gént tartalmazó DNS alkalmazása, valamint az először Sál I.-gyel végzett hasítás és az első transzformáció után kapott plazmid-DNS Hind lIL-mal vagy Eco R I.-gyel végzett elbontása, mivel ezek a restrikciós endonukleázok a DNS-nek a találmány szempontjából kritikus helyein hajtanak végre hasítást. A 4 megadaltonos fragmentum és a lebontott vektor rekombinációjához elvben bármely megfelelő DNS-ligáz alkalmazható. Előnyben részesítjük a T4 fág DNS-ligázát. Az újra-egyesítés úgy történik, hogy a megfelelő oldatokat ATP, egy szulfhidril vegyület és magnézium ionok jelenlétében egyszerűen összekeverjük. Annak érdekében, hogy az újra-egyesítés után megtaláljuk azokat a sejteket, amelyekben az alfa-galaktozidáz gént tartalmazó vektor fordul elő, a tenyésztést olyan minimál -táptalajon hajtjuk végre, amely egyetlen szén forrásként raffinózt, valamint a szükséges sókat tartalmazza. Antibiotikum-rezisztencia géneket tartalmazó vektor alkalmazása esetén a táptalajhoz előnyösen még egy antibiotikumot is adunk, amellyel szemben rezisztencia-gének találhatók a vektorban. A PBR 322 plazmid pl. ampicillinnel és tetraciklinnel szembeni rezisztencia-géneket tartalmaz, úgyhogy ebben az esetben előnyösen egyik ilyen antibiotikumot alkalmazzuk; ez ugyanis elnyomja azoknak a sejteknek a növekedését, amelyek ezt a gént a transzformáció után nem tartalmazzák. Minimál táptalajon itt olyan táptalajt értünk, amely a szükséges sókon kívül csak raffinózt tartalmaz. A fenti módon kapott hibrid plazmid DNS- nek Hind III-mal vagy Eco R I.-gyel végzett hasítása a raffinóz-permeáz és az invertáz expresszióját kódoló génszekvenciák kiiktatásához vezet. A DNS-ligázzal végzett renaturálás révén ezért olyan vektorokhoz jutunk, amelyek ezeket a kívánt eljárásban nemkívánatos géneket már nem tartalmazzák és alkalmazhatók a második lépésben végzett transz-4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
