193234. lajstromszámú szabadalom • Eljárás optikailag aktív 3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin és származékai előállítására
193234 kor az a cél, hogy egy optikailag aktív 3-(3.4- -dihidroxi-fenil)-szerint állítsunk elő, az (I) képletü, szubsztrátként alkalmazott szerínvegyület katekolos hidroxilcsoportjai szabadok lehetnek. Másfelől, ha végül is egy optikailag aktív 3-(3,4-dihidroxi-fenil)-N-metil-szerin előállítása a cél, egy utólagos N-metilezés révén, akkor a találmányi eljárásban szereplő enzimatikus reakciót célszerűen úgy kell lejátszatni, hogy a kiindulási, (I) általános képletü DL-szerin-vegyület katekolos hidroxilcsöportjain védett származéka alakjában legyen jelen, mert a szerinszármazék katekolos hidroxilcsoportjain védelemben kell részesülniük a rákövetkező N-metilezési reakciólépés miatt. Ha a találmány szerinti eljárás kivitelezésénél a katekolos hidroxilcsoportjain védett N-acil-DL-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin-származékot használunk, akkor természetesen könnyűszerrel megkaphatjuk az optikailag aktív 3- - (3,4-dihidroxi-fenil)-szerint a hidroxil-védőcsoportoknak a dezacilezett termékről történő, hagyományos védőcsoport-eltávolítási eljárást alkalmazó eltávolítása útján, az enzimreakció végrehajtását követően. Az (I) általános képletü N-acil-DL-3-(3,4- -dihidroxi-íenil) -szerin-vegyület katekolos, 3- és 4-helyzetű hidroxilcsoportjainak védelmére szolgáló R) R2 hidroxil-védőcsoportok lehetnek: fenil-(1-4 szénatomos) alkil-, naftil- (1-4 szénatomos) alkil-csoport vagy R‘ és R2 együttesen (1-4 szénatomos) alkilén láncot képez. A találmány szerinti eljárásban szereplő enzimreakciót, amelynek folyamán az (I) általános képletü N-acil-DL-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-vegyületeket a mikroorganizmus, vagy a mikroorganizmusból származó aciláz enzim segítségével dezacilezzük, célszerűen pH 5 és 9 között, előnyösen 5 és 6 közötti pH-értéken, 20° és 80°C közötti hőmérsékleten, előnyösen 35° és 60°C közé eső hőmérsékleten végezzük. A reakcióközeg lehet víz, amely nem tartalmaz, vagy kívánt esetben tartalmaz megfelelő arányban egy olyan szerves oldószert, amely nem inaktiválja az enzimet, így például valamilyen kisszénatomszámú alkoholt, például etanolt. Kívánt esetben, vagy ha ez előnnyel jár, az enzimreakciót végezhetjük valamilyen fémkation, így például katalizátorként hozzáadott kobalt jelenlétében. A szükséges reakcióidő a felhasznált enzim mennyisége és aktivitása függvényében változhat; befolyással lehet rá a reakcióhőmérséklet és különböző más tényezők, de a reakcióidő normális esetben 30 perc és 20 óra között van. Egy 2 óra és 18 óra közé eső időtartam a legtöbb esetben elegendő a reakció lefolyásához. Az enzimatikus reakciót követően hajthatjuk végre a keletkezett L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin, illetve (II) általános képletü katekolos hidroxilcsoportjain védett származékának a (III) általános képletü N-acil-D-9-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerintői, illetve katekolos hidroxilcsoportjain védett származékától való elválasztását. Ez utóbbi vegyület ugyanis, miután nem vesz részt az enzimkatalizálta dezacilezésben, változatlanul viszszamarad a reakció lezajlása után. Az elkülönített lecsapás segítségével végezhetjük, felhasználva azt a körülményt, hogy laz N-acií-D-3- (3,4-dihidroxi-fenil) - szerin-vegyületek általában kevésbé oldhatók vizes közegben, mint az L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-vegyületek, a savas pH-tartományban. Más megoldásként a (II) általános képletü L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-vegyület és a (III) képletü N-acil-D-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-vegyület elkülönítését egy „fázisátvitel-kioldási" módszer alkalmazásával érhetjük el, amint azt a későbbiekben a 2. példában bemutatjuk. Az eljárás kivitele a következő: az enzimes reakció reakcióelegyét n-butanollal extraháljuk; e művelet eredményeképpen egy olyan n-butanolos oldatot kapunk, amelyben mind a (II) általános képletű L-vegyület, mind a (III) általános képletü D-vegyület oldott állapotban van jelen. Az n-butanolt az oldatból elpárologtatjuk, a kapott maradékot 0,05 M pH=7,0 foszfátpufferben felvesszük, az így kapott oldatot, amely mind a (II), mind a (III) általános képletü vegyületet tartalmazza, sósavval megsavanyítjuk, majd etil-acetáttal extraháljuk a megsavanyított oldatot, miáltal főleg a (III) általános képletü vegyület oldódik át az etil-acetátba. Az etil-acetátos fázist ezután lúgos kémhatású (pH=9) vizes oldattal rázzuk ki, hogy a (III) általános képletü vegyületet ezáltal a vizes fázisba vigyük át, mely utóbbit savas (pH=l) körülmények között ismételten etil-acetáttal rázunk ki, és így tovább. A találmány szerinti eljárással kapott (II) és (III) általános képletü végtermékeket azután külön-külön izolálhatjuk és a szokásos kromatográfiás módszerrel tisztíthatjuk. A kromatográfiás tisztítási eljárás például szilikagél töltetű oszlopon történő kromatografálást vagy ioncserélő gyantán végzett kromatografálást jelent. Arra is lehetőség van, hogy a végtermékek izolálását és tisztítását egy nagyon egyszerű módon végezzük, például úgy, hogy — a (II) és (III) általános képletü termékek oldékonyságának különbségét kihasználva — a lecsapásos vagy a kristályosításos eljárást alkalmazzuk. A következőkben találmányunkat példákkal illusztráljuk, anélkül azonban, hogy találmányunkat bármilyen tekintetben e példákra korlátoznánk. 1. példa (a) A mikroorganizmus tenyésztéshez alkalmazott tápközeg a következő anyagokat tartalmazta: 1% burgonyakeményítő, 1% glükóz, 0,75% húskivonat, 0,75% polipepton, 0,3% nátrium-klorid, 0,1% magnézium-szulfát-heptahidrát, 0,0007% réz(II)-szulfát-pentahidrát, 0,0001% vas(II)-szulfát-heptahid-7 10 5 10 15 20 45 30 35 40 45 50 55 60 65
