193234. lajstromszámú szabadalom • Eljárás optikailag aktív 3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin és származékai előállítására
193234 rát, 0,0008% mangán(II)-klorid-tetrahidrát és 0,0002% cink-szulfát-heptahidrát. A tápközeget 100 ml-es részletekben 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba töltöttük, majd a tápközeget a Streptomyces hachijoensis (IMC S-0244) (ISP 5114) (FERM P-7218) (FERM BP 642) ferde tenyészetének egy oltókacsnyi mennyiségével beoltottuk. Az inkubációt 27°C hőmérsékleten, rázatás mellett, 3 napon keresztül végeztük egy törzstenyészet előállítása céljából. A törzstenyészet 10-10 ml-ét a fent leírttal azonos összetételű tápközegbe oltottuk, amelyet 1-1 literes részletekben 5 l-es Erlenmeyer-lombikokba adagoltunk. Az inkubációt 27°C-on rázatás mellett 4 napon keresztül folytattuk. Az így nyert tenyészoldatot megszűrtök a mikróbasejtek eltávolítása végett, és a kapott (3 liter) szűrlethez kis részletekben, keverés közben ammónium-szulfátot adagoltunk a 80%-os telítettség eléréséig. Az elegyet ezután 5°C hőmérsékletű hidegszobában éjszakán át állni hagytuk, majd 9000 fordulat/perc fordulatszám és 5°C hőmérséklet fenntartása mellett lecentrifugáltuk. A kivált enzimtartalmú csapadékot összegyűjtöttük és 150 ml 0,05 M foszfátpufferben feloldottuk. Ily módon egy nyers acilázenzim-oldatot kaptunk. (b) 1 g DL-treo-N-acetil-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerinhez 60 ml vizet adtunk, és az így kapott vizes szuszpenzióhoz cseppenként 30%-os vizes nátrium-hidroxid-oldatot adagoltunk mindaddig, amíg a DL-szerin-vegyület feloldódása következtében víz tiszta oldatot nem kaptunk. Ehhez az oldathoz 20 ml 0,5 M 7,0 pH-jú foszfátpuffert öntöttünk, majd annyi vizet adtunk, amennyi áz oldat térfogatát 90 ml-re egészítette ki. A szubsztrát szerin-vegyület ily módon előállított oldatát 10 ml fent leírt módon előállított enzimoldattal kevertük össze, majd 37°C-on 18 órára inkubáltuk az enzimatikus reakció lefolytatása céljából. A reakció lezajlása után a reakcióelegyet leszűrtük, a képződött csapadékot eltávolítottuk. Az így nyert szűrlet pH-ját sósav hozzáadásával 1-re állítottuk be, és az ennek nyomán kivált csapadékot szűrőre gyűjtöttük. Ily módon első nyeredékként 150 mg D-treo-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerint kaptunk. Az említett reakcióelegy szűrésekor kapott első csapadékot 0,1 n sósavoldatban melegítés közben feloldottuk. A kapott oldatot szobahőmérsékleten állni hagytuk, miáltal egy csapadék vált ki. E csapadékot a folyékony fázistól szűréssel elkülönítettük; ily módon 240 mg D-treo-N-acetil-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerinhez jutottunk, második nyeredék formájában. Az első és második nyeredékként kapott termék egyaránt [a]p°=-20,9o fajlagos forgatóképességet mutatott (c=l, etanotban). A D-izomer második nyeredékének (240 mg) szűréssel történt elválasztása után visszamaradt szűrletet n-butanollal extraháltuk, az n-butanolos extraktumot csökkentett nyomáson desztillációnak vetettük alá az n-butanol eltávolítása céljából. A maradékot izo-11 8 propanolból kikristályosítva 360 mg L-treo-3- - (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin-hidrokloridot kaptunk, amelynek fajlagos forgatóképessége [a]p0=-5,99o volt (c=l, etanolban). (c) A fenti módon előállított D-treo-N-acetil-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint 1:1 terfogatarányú metanol — In sósavoldat elegyében feloldottuk, és az oldatot 5 órán keresztül viszszafolyató hűtés mellett forraltuk az N-acetilcsoport eltávolítása céljából, hogy ezáltal D-treo-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerint kapjunk. Ezalatt a fentebb leírt módon kapott L-treo-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin-hidrokloridot etanolban feloldottuk és katalitikus redukciónak (hidrogenolízis) vetettük alá az oldatot hidrogéngáz-atmoszférában, 105 Pa nyomáson, szobahőmérsékleten, 10%-os palládium/csontszén katalizátor jelenlétében. A hidrogenolitikus reakció — mint a katekolos hidroxilcsoportokat védő benzilcsoportok eltávolításának szokásos módja — kivitelezésével 100%-os hozammal kaptuk meg az L-treo-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerint. 2. példa (a) Az 1. példában leírttal megegyező öszszetételű tápközeget Actinomyces aureoverticillatus (IMC S-0243) (ISP 5080) (FERM P-7216) (FERM Bp-640) ferde tenyészetének egy oltókacsnyi mennyiségével beoltottuk, és a beoltott tápközeget 27°C hőmérsékleten 5 napon át inkubáltuk. Az így nyert tenyészoldatot a mikróbasejtek eltávolítása végett leszűrtük, és a kapott, az aciláz enzimet tartalmazó szűrlet 100 mi éhez 108 mg DL-eritro-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerint adtunk. Az elegyet 37°C-on 18 órán keresztül inkubáltuk az enzimreakció lejátszatása céljából. (b) A reakció végeztével a reakcióelegy pH-ját 2-re állítottuk be sósav hozzáadásával, majd n-butanollal extraháltuk. Az n-butanolos extraktumot csökkentett nyomáson desztilláltuk az n-butanol eltávolítása érdekében, s a desztillálási maradékot 7,0 pH-jú 0,05 M foszfátpufferben vettük fel. Az így kapott oldat pH-ját vizes sósavoldattal újra 2-re állítottuk be, majd etil-acetáttal kiráztuk. A kapott szerves extraktumot, amely az etil-acetátba átoldódott D-eritro-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint tartalmazta, vízzel elegyítettük, és az elegy pH-ját 9-re állítottuk be vizes nátrium-hidroxid-oldat segítségével. Ekként a D-eritro-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerin átoldódott a vizes fázisba. A vizes fázis pH-ját ezt követően sósavval pH=l-re állítottuk, és a megsavanyított vizes oldatot etil-acetáttal ismételten kiráztuk. Az így nyert etil-acetátos extraktumot csökkentett nyomáson desztilláltuk az etil-acetát eltávolítása végett. Ily módon 34 mg D-eritro-N-acetil-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint kaptunk. [<x]b°=-I4,6° (c=1, etanolban). (c) A fenti (b) eljárás során kapott, fentemlített desztillálási maradék sósavval pH=2- -re megsavanyított oldatának etil-acetátos extrakciója után visszamaradt vizes fázist 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
