193087. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új LL-D 42067 alfa és LL-D 42067 béta antibiotikumok és hatóanyagként ezeket tartalmazó állatgyógyászati készítmények előállítására
193087 Az LL-D 42067 ß antibiotikum izolálásánál a fermentlevet diatomaföldön átszűrjük, majd szerves oldószerbe, mint például etil-acetátba átextraháljuk. Az extraktumot bepároljuk, majd heptán-metanol elegyben megosztjuk. A metanolos fázist bepároljuk. A kapott maradékot hexánnal trituráljuk, majd bepároljuk. A maradékot 1:1 térfogatarányú acetonitril-víz elegyében feloldjuk és bekoncentráljuk. Csapadék válik ki, amit fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítunk, eluálószerként acetonitril-víz-ecetsav 3000:6000:5 arányú oldószerelegyet használva. Az aktív hatóanyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, majd bepároljuk. A kapott vizes szuszpenziót etil-acetáttal extraháljuk. Az oldószer eltávolítása után tiszta LL-D 42067 ß antibiotikumot nyerünk. t. példa lnokulum készítés A tenyésztéshez használható táptalaj öszszetétele például a következő: Glükóz: 1,0% Dextrin: 2,0% Élesztő kivonat: 0,5% N-Z Amin A': 0,5% Kálcium-karbonát 0,1% Víz 100,0%-ra feltöltve 1 = Hasnyálmirigy kivonat, gyártócég: Sheffield Chemical, Norwich, New York. A fenti összetételű táptalaj pH-ját 7,2-re állítjuk be, majd sterilizáljuk. 100 ml steril táptalajt 500 ml-es edényekbe mérünk be, és a táptalajt oltókaccsal beoltjuk az Actinomadura madurae simaoensis NRRL 15734 mikroorganizmus ferde agaron fenntartott tenyészetéből. Az edényeket ezután forgó keverőre helyezzük és 20 íordulat/perc sebességgel kevertetjük 48 órán át,28°C hőmérsékleten. Ezt az inokulum tenyészetet használjuk 12 liter fenti összetétellel megegyező összetételű táptalajt tartalmazó fermentorok beoltásához. A tenyésztést itt 28°C hőmérsékleten 48 órán át végezzük. Az így kapott másodlagos inokulumot oltóanyagként használjuk. 2. példa Fermentálás A következő táptalaj megfelelő a tartályfermentorokban a tenyésztésre: Szacharóz: 3,0 tömeg% Szójaliszt: 1,5 tömeg% Kukoricalekvár: 0,5 tömeg% Kálcium-karbonát: 0,5 tömeg% Víz: 100,0 tömeg%-ra feltöltve 300 1 steril táptalajt az 1. példában ismertetett módon előállított 12 1 másodlagos inokulummal beoltunk. A fermentálást 28°C hőmérsékleten, 200 1/perc sebességű levegő-befűvatás, valamint egy 230 fordulat/perc sebességgel működő keverővei történő kevertetés mellett 135 — 159 órán át végezzük. Ezután a fermentlevet diatomaföldön átszűrjük. 3. példa LL-D 42067 a izolálása a fermentléből A 2. példában ismertetett módszer szerint végzett 3 fermentációs eljárás szürletét egye-19 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20 sítjük. Az így kapott 900 I egyesített fermentlé pH-ját 7,5-re állítjuk be és 900 1 metilén-kloriddal extraháljuk. A szerves fázist vákuum alkalmazásával bepároljuk, 84,1 g maradékot kapunk. A bepárolt maradékból 75,2 g-ot 300 ml hexán-etil-acetát 80:20 arányú elegyében etszuszpendáljuk, majd szilikagélle! töltött oszlopon kromatografáljuk. Eluálásra öszszesen 4 I fentiekben ismertetett oldószerelegyet használunk, abból a célból, hogy a zsírokat és a szilikonolajat eltávolítsuk, majd ezután 4 1 metilén-klorid: 1%-os ecetsav metanolban 9:1 arányú elegyét használjuk, 15 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel analizáljuk. Az LL-D 42067 a antibiotikum egy látható sárga foltot ad (Rf érték = 0,5) a föntiekben ismertetett oldószerrendszert használva futtatószerként. A 31-60 frakciókat, amik az antibiotikum többségét tartalmazzák, összeöntjük, vákuum alkalmazásával bepároljuk. 11,1 g vörös színű anyagot kapunk. Az így kapott anyagból 5,5 g-ot nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel [Prep LC Systen-500, Prep- PAK-500/C18 töltet, mozgófázisként acetonitri!:víz:ecetsav 600:400:0,28 arányú elegyét használva, 100 ml/perc sebességnél 5,5 g/ /30 ml beadagolás] tisztítjuk. Harminc 200 ml-es frakciót gyűjtünk össze. Nagynyomású folyadékkromatográfiás analízissel megállapítottuk, hogy az LL-D 42067 oc főtömegében az 5. frakcióban található. Az 5. frakciót egy éjszakán át állni hagyjuk. Sárga kristályok válnak ki, amit összegyűjtünk oly módon, hogy az anyalugot dekantáljuk, a kristályokat mossuk, szárítjuk. 11 mg LL-D 42067 a-át kapunk, sárga, kristályos formában. Az anyalugot bepároljuk. Az anyalúgból kiváló csapadékot centrifugáljuk. 377 mg LL-D 42067 a-át kapunk, sárga amorf, szilárd anyag formájában. A nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis körülményei a következők: Kolonna: p Bondapak C18, 3,9 mm x x 30 cm, Waters Assoc. Mozgó fázis: acetonitril:víz:ecetsav (400:600: :0,28) Detektor: UV 254 nm és UV 365 nm, 0,2 AUFS Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc LL-D 42067 a retenciós térfogata: 11,5 ml. A kapott anyag fizikai jellemzőit a leírás első része ismerteti. 4 példa lnokulum hígítást sor készítése A hígítási sor elkészítésénél például a következő összetételű táptalajon végezhetjük a tenyésztést: Dextróz: L0% Dextrin: 2,0% Élesztő kivonat: 0,5% NZ Amin A1: 0,5% Kálcium-karbonát: 0,1% Víz: 100,0%-ra feltöltve 11
