193087. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új LL-D 42067 alfa és LL-D 42067 béta antibiotikumok és hatóanyagként ezeket tartalmazó állatgyógyászati készítmények előállítására
193087 21 22 1 = Hasnyálmirigy kivonat, gyártócég: Sheffield Chemical, Norwich, New York. A fenti összetételű táptalajt sterilizáljuk, majd e táptalaj 100 ml-ét oltókaccsal beoltjuk az Actinomadura madurae simaoensis NRRL 15734 deponálási számú mikroorganizmus ferde agaron fenntartott tenyészetéből. A tenyészetet ezután forgó keverővei kevertetjük és 48 — 72 órán át, 28°C hőmérsékleten tartjuk. Az elsődleges inokulumot ezután 10 1 fentivel megegyező összetétélű steril táptalajba oltjuk be, ahol 48 órán át, 28°C hőmérsékleten tartjuk. A másodlagos inokulumot egy 250 1 fenti összetétellel megegyező összetételű táptalajt tartalmazó fermentor tartályba oltjuk, ahol a levegőztetést 200 1/perc sebességű steril levegő befúvásával biztosítjuk. A fermentálást 58 órán keresztül, 28°C hőmérsékleten végezzük. Az így kapott harmadlagos inokulumot oltóanyagként használjuk. 5. példa Fermentálás A következő táptalajt használjuk a tartály fermentorokban: Szacharóz: 3,0 tömeg% Szójaliszt: 1,5 tömeg% Kukoricalekvár 0,5 tömeg% Kálcium-karbonát: 0,5 tömeg% Víz: 100,0 tömeg%-ra feltöltve A táptalajt sterilizáljuk, majd 300 1 steril táptalajt 125 1 az 1. példában ismertetett eljárással előállított harmadlagos inokulummal beoltunk. A fermentálást 28°C hőmérsékleten, 6,6 1/1 fermçntlé levegőbefűvással és llOfordulat/perc sebességgel működő keverővei történő kevertetés mellett 137 órán át végezzük. A táptalajhoz a habzás megakadályozására szilikon habzásgátlószert adagolunk be. 6. példa LL-D 42067 ß izolálása fermentléből 5 10 15 20 25 30 35 40 A 2. példában ismertetett fermentációs módszerrel 4500 1 fermentlét gyűjtünk össze, majd hozzáadunk 1 térfogat% diatomaföl- 45 det. Az elegyet 1 órán keresztül kevertetjük, majd pH-ját 3,0 — 0,3 értékre állítjuk be, koncentrált sósavat alkalmazva. Az elegyhez az össztérfogat felével megegyező térfogatú etil- 5q -acetátot adunk és az így kapott elegyet 3 órán át kevertetjük. Ezután a keverékhez 5 térfogat% diatomaföldet adunk, majd az elegyet leszűrjük. Az etil-acetátos fázist elkülönítjük, 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mossuk, majd bepáróljuk. Szirupszerű anyagot kapunk, amit heptán-metanol,2:l arányú elegyében megosztunk. A 4,5 1 metanolos fázist bepároljuk és a maradékot hexánnal trituráljuk. A hexánt dekantáljuk,a maradékot szárazra pároljuk. Az így 60 kapott anyagot fordított fázisú preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítjuk tovább. A tisztítás körülményei: Kolonna: PrepPAK* -500/C18 töltet 65 Mozgó fázis: 1. Acetonitril:víz:ecetsav (8000: : 12000:10) 2. Acetonitril:víz:ecetsav (3000: :6000:5) Áramlási sebesség: 50 ml/perc Frakciók: 200 ml/frakció Minta adag: 2-3 g/30 ml adag. Az 1. mozgófázist használva az LL-D 42067 ß-át a 7-10, frakciókban kapjuk. A frakciókat egyesítjük és vákuum alkalmazásával bepároljuk abból a célból, hogy az aceto-nitrilt eltávolítsuk. A maradék vizes szuszpenziót térfogatával megegyező térfogatú etil-acetáttal kezeljük. Az etil-acetátos fázist elválasztjuk, majd egymás után egyenlő térfogatnyi 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, és 0,1 n sósavval, majd kétszer vízzel mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd szilárd termékig bepároljuk. A kapott szilárd anyagot ismét kromatográfiás módszerrel tisztítjuk, mozgófázisként a 2. fázist alkalmazva. Az LL-D 42067 p-át a 15-21 frakciókban kapjuk. Ezeket a frakciókat egyesítjük, a fenti módon ismertetett eljárással kezeljük. Tiszta LL-D 42067 ß-át kapunk, sárga, szilárd anyag formájában. A kapott anyag fizikai tulajdonságai azonosak a leírás elején összefoglalt adatokkal. 7. példa Coccidiosis-ellenes hatás vizsgálata Az LL-D 42067 a és LL-D 42067 ß antibiotikumok coccidiosis-ellenes hatását csirkék fertőzöttsége esetében a következő vizsgálattal határozzuk meg: Az állatok tápjának összetétele: Vitamin-aminosav premix 0,5 tömeg% Nyomelemek Nátrium-klorid Dikalcium-foszfát Őrölt mészkő Stabilizált zsír Hidrolizált lucerna, fehérje 17% Kukoricacső liszt Menhaden halliszt, fehérje 60% Szójaolaj liszt, fehérje 44% őrölt sárga kukoricával kiegészítve A vitamin-aminosav premix összetétele a vetkező: Hidroxi-toluol-butil-éter dl-Metionin A vitamin 0,1 tömeg% 0,3 tömegje 1,2 tömeg'% 0,5 tömeg% 4.0 tömeg% 2.0 tömeg % 5.0 tömeg% 5.0 tömeg% 30.0 tömeg% 100.0 tömeg% D3 vitamin Riboflavin E vitamin Niacin Pantoténsav Kolin-klorid Polsav Menadion-nátrium-hidro-gén-szulfát 125.0 mg 500.0 mg 3300.0 LU. 1100.0 I.C.U 4,4 mg 2,2 l.U 27,5 mg 8,8 mg 500.0 mg 1,43 mg 1,10 mg kö-12
