193065. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-[2-[4-(1H-imidazol-1-il)-fenil]-alkil vagy -alkenil ]-3(2H)-piridazinon-származékok és az ezeket hatóanyagként tartalmazó készítmények előállítására
5 193065 lisan (szájon át) vagy parenterálisan (a gyomor- és bélrendszer megkerülésével) egy megfelelő, valamely fent megadott (I) általános képletú vegyületet tartalmazó, alkalmas dózisegység-formájú gyógyászati készítményt adunk be. A jelen találmány szerinti vegyületek mint trombózis-ellenes szerek hasznosságát a humán (emberből származó), vérlemezkékben gazdag plazmával végzett, szokásos in vitro vérlemezke-aggregációs (-tömörödési) vizsgálatban megmutatkozó hatásukkal igazolhatjuk. A vérlemezkéket tartalmazó plazma-minták eredete A vérmintákat olyan önkéntes véradóktól vesszük, akik a vérvételt megelőző két héten át nem szedtek sem aszpirint, sem más, nem-szteroid gyulladáscsökkentőt,és a vérvétel előtt 9 órán át nem étkeztek. A vérmintákat 4.5 ml térfogatú részletekben Vacutainer 6462S jelzésű, szilikonbélésű csövekbe gyűjtjük, a csövekbe előzőleg 0,5 ml 3,8%-os trinátrium-citrát-oldatot teszünk. Egy-egy önkéntes véradótól általában 6, egyenként 4.5 ml térfogatú vérmintát veszünk. A három vagy négy önkéntes véradótól levett vérmintákat centrifugálás előtt egyesítjük. Az egyesített vérmintákat 50 ml térfogatú polietilén-csövekbe tesszük, és 20 percig szobahőmérsékleten, egy 240 jelzésű forgórészt tartalmazó International Model K típusú centrifugán 8 x g gyorsulással (körülbelül 600 fordulat/perc/ centrifugáljuk. Utána a felülúszó, vérlemezkékben gazdag plazma egy részét (körülbelül 2/3-át/ leöntjük és félretesszük, majd a vérminták maradékát negyed órán át 1400 x g gyorsulással (körülbelül 2800 fordulat/perc/ centrifugáljuk, és így vérlemezkékben szegény plazmát kapunk. A vérlemezkékben gazdag plazma térfogategységében lévő vérlemezkék számát egy Coulter-féle vériemezke-számlálóval határozzuk meg. A vérlemezkékben gazdag plazma vérlemezke-koncentrációját a vérlemezkékben szegény plazma felhasználásával 250.000 vérlemezke/mikroliterre állítjuk be. A vizsgálati vegyületek oldatainak elkészítése A vizsgálandó vegyületeket kis mennyiségű dimetil-szulíoxidban oldjuk, majd az oldatokat fiziológiás nátrium-klorid-oldattal hígítjuk (a dimetil-szulfoxid végső koncentrációja: 1%). A további, kisebb koncentrációjú oldatokat fiziológiás nátrium-klorid-oldattal való hígítás útján készítjük el. Az aggregáció vizsgálati módszere A 250.000 vériemezke/mikroliter koncentrációra beállított, vérlemezkékben gazdag plazma 0,36 ml térfogatú részleteit 0,79 cm átmérőjű, szilikonbélésü küvettákba töltjük. E mintákhoz hozzáadjuk a vizsgálandó vegyületek oldatait vagy fiziológiás nátrium-klorid-oldatot (0,02 ml), majd az aggregációt kiváltó szert (adenozin-diíoszfátot vagy kollagén-szuszpenziót, 0,02 ml). 4 Az aggregáció mértékét (az adenozin-difoszfát esetében), illetve az aggregáció sebességét (a kollagén esetében) egy Payton-féle kétcsatornás, kísérleti aggregációmérő egység (300B jelzésű modell) segítségével határozzuk meg. Az aggregációt kiváltó szerek alkalmas koncentrációit rövid előtitrálással állítjuk be. Számítások Adenozin-difoszfáttal kiváltott aggregáció A hatóanyag nélkül, csak fiziológiás nátrium-klorid-oldat hozzáadásával végzett aggregációs kontroll kísérletek során kapott aggregációs görbék mm-ben mért magasságát összehasonlítjuk a hatóanyagok különböző, alkalmas koncentrációinak felhasználásával kapott görbék magasságával. A hatóanyagokkal végzett kísérletekben kapott görbék magasságát' a kontroll kísérletek görbéi magasságának százalékában adjuk meg. Ezeket az értékeket a hatóanyag koncentrációjának függvényében fél-logaritmus papíron ábrázoljuk. Az IC50-értékeket (az aggregációt 50%-ban gátló koncentrációkat) az így kapott görbékből becslés útján határozzuk meg. Kollagénnel kiváltott aggregáció Meghatározzuk a kollagénnel kiváltott agg;regácíós kísérletekben kapott aggregációs görbék fő szakaszainak meredekségét (vagyis a leghosszabb egyenes szakasz meredekségét) és összehasonlítjuk a csak fiziológiás nátrium-klorid-oldat és aggregáló szer hozzáadásával végzett aggregációs kontroll kísérletekben kapott görbék meredekségével. Az így kapott értékeket a kontroll kísérletek értékei százalékában adjuk meg. Ezeket a százalékos értékeket a hatóanyag koncentrációja függvényében fél-logaritmus papíron ábrázoljuk. Az IC50-értékeket az így kapott görbékből becslés útján határozzuk meg. A fenti kísérletben a 4,5-dihidro-6- [2 [4- ( 1 H-imidazol-1 - il ) -fenil] -et en il ] -5- -metil-(3(2H)-piperidazinon nagyon erősen gátolja a kollagénnel kiváltott aggregációt (IC50 = 7.10”TMmól) és gátolja az adenozin-trifoszfáttal kiváltott aggregációt (IC50 = 1.10'7 mól). Ennek megfelelően a jelen találmány szerinti vegyületek alkalmasak továbbá trombózisban szenvedő emlősök kezelésére, oly módon, hogy az ilyen emlősöknek orálisan vagy parenterálisan egy megfelelő, valamely fent megadott (1) általános képletű vegyületet tartalmazó dózisegység-formájú gyógyászati készítményt adunk be. A jelen találmány szerinti gyógyászati készítmények előállításához használt semleges, gyógyászatiig elfogadható vivőanyagok lehetnek szilárd vagy cseppfolyós halmazállapotúak. Szilárd halmazállapotú készítmények például a porok, tabletták, diszpergalható granulátumok, kapszulák, keményítő-kapszulák és a kúpok. A szilárd vivőanyag egy vagy több anyagból állhat, az 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
