193060. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-39079 antibiotikum S-1faktor előállítására
193060 5) Mag-mágneses rezonancia spektroszkópia" (NMR) : a) ÀI3C NMR vizsgálatot deuterált kloroformban, íetradeutero-metanolban vagy hexadeiltero-acetonban végezzük. A protonált 5 szénatomok rezonanciáit egyszeri frekvencia-szétcsatolási technikával azonosítottuk. A többi szénatom frekvenciáinak azonosítását teljesen csatolt spektrumból, valamint a rifamicin A39079 faktor S-1 (2): .1 Rifamicin S (3): S irodalmi értékeivel való összehasonlítással nyerjük. Harminchat külön szén-frekvencia jelentkezik, ami megegyezik a nagy felbontóképességű tömeg-spektronkópfás elemanafizis adataival. Az A39079 S-1 faktor 13C adatainak összehasonlítása a rifamicin S adataival három helyettesítésbeli eltérést mutat a (IV) általános képlet szerint: 2 Ki Rz r3 ch3 H H H CHa CH, b) A proton NMR vizsgálatokat tetradeutero-metanolban, deutero-kloroformban és hexadeutero-acetonban végezzük. A rifamicin S proton NMR adataival összehasonlítva a 3., 16. és 27. szénatom helyettesítésében van eltérés. Az NMR spektrumot 360 MHz-es és 270 MHz-e.s készülékeken vesszük fel, ismert szétcsatolási technikákat alkalmazva. A szétcsatolási adatok egy ansa lánc (azaz a rifamicinekre jellemző alapváz) jelenlétét mutatják, amely a 16-os és 27-es helyen (R2 és R3) különbözik a tipikus rifamicinekben levő lánctól. A gyűrű hármas helyén (R,) levő proton hiánya, kapcsolva a 13C spektrumban lévő aromás metil csúccsal igazolta egy metil-csoport jelenlétét a C-3-as helyzetében. 6) Stabilitás: Az S-1 faktor stabilitásának vizsgálatát vizes metanolos oldatokban végezzük 2, 5, 7 és 9-es pH értékeken,4, 25 és 37 °C-on. Ezekben a vizsgálatokban S-1 sokkal stabilabb enyhén savas, semleges és lúgos oldatokban mint erősen savas oldatokban (pH —2), a vizsgált hőmérsékletek közül legstabilabb 4°C-on,kevésbé stabil 25°C-on és legkevésbé stabil 37 °C-on. 7) Kromatográfia a) Analitikai nagynyomású folyadék-kromatográfia (HPLC). Oszlop: 0,64 x 12,5 cm Töltet: Zorbax ÓDS (6 p, E.I. DuPont) Oldószer: acetonitril:víz:trifluor-ecetsav (56: :43, 996:0,004), pH = 4,6. Áramlási sebesség: 1 ml/perc Detektálás: UV 264 nm-en Mennyiségi értékelés: Micrometries 740 mikroprocesszor adat-csomaggal (Micromertics Corp.).Az S-1 retenciós ideje: 5,6 perc (k’= 3.74). b) Vékonyr'éteg-kromatográfia (TLC) Réteg: szilikagél (Whatman LKDSF lemezek) Oldószer :kloroform: metanol: ammoniúm-hidroxid (90:9,5:0,5) Kimutatás: UV és bioantográfia Staphylococcus aureus-szal. Rf érték: 0.7. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy az A39079 S-1 faktor acil-észter ^származékokat tud képezni. Ezek a származékok jól használhatók az S-1 faktor izolálásában, tisztításában és adagolásában. Az A39079 S-1 faktor acil-észter származékait acilező szerrel, ismert eljárásokat hasz- 20 nálva állíthatjuk elő. Az ehhez a reakcióhoz megfelelő oldószerek közé tartozik a piridin és trietilamin. A tipikus acilqző szerek közé tartoznak a savanhidridek, savhalogenidek (általában savkötő anyaggal kombinálva), vala- 25 mint a szerves savak aktív észterei. Az acilezést végrehajthatjuk úgy is, hogy szerves sav és dehidratáló anyag,például N,N’-diciklohexil-karbodiimid keverékét használjuk. Az észterezést ismert módszerekkel, például vékony- 30 réteg kromatográfiával követhetjük, hogy meghatározzuk a kívánt reakció lejátszódásához szükséges időt. A létrejött megfelelő észter-származékokat ismert módszerekkel választhatjuk el és tisztíthatjuk. 35 A találmány tárgya eljárás S-1 faktor előállítására, és kloramfenikoltól, cikloheximidtől, aktifenoltól és szeptacidintől történő elvá-i lasztására, oly módon, hogy a Streptomyces spheroides új törzsét süllyesztett-levegozte- 40 tett fermentációs körülmények között tenyésztjük mindaddig, míg megfelelő szintű antibiotikum-aktivitás jön létre, majd az egyes antibiotikumokat a fermentléből kinyerjük. A kloramfenikol jól ismert, kereskedelmi forgalom- 45 ban levő baktérium-ellenes szer. A cikloheximid (lásd a 2 574 519 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírást) és szeptacidin hasznos gombaellenes szerek. így ezen anyagok mindegyikének előállítása a Strepto- 50 myces spheroides tenyészettel további előnyös vonása a jelen találmánynak. Az A39079 S-1 faktor előállítására használható Streptomyces spheroides^ törzset letétbe helyeztük (1983. szeptember 8-án) és a 55 Northern Regional Research Center, U.S.Department of Agriculture, 1815 N. University St., Peoria, Illionis 61604, Agricultural Research Culture Collection állandó gyűjteményének része lett, ahol bárki számára hozzáfér- 00 hető az bJRRL 15600 sorszám alatt. A Streptomyces spheroides NRRL 15600 törzset vancuveri (British Columbia, Canada) talajmintából izoláltuk. Ezt a szervezetet Wallich és munkatársai Streptomyces bt> spheroides-nek írták le. Ez az osztályozás 3
