193051. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nisztatin előállítására új streptomyces törzzsel
kalcium-, kálium-, nátrium-sókat tartalmazó táptalajon, aerob körülmények között, 25- 35°C közötti, előnyösen 26-30°C közötti hőmérsékleten tenyésztjük, majd a keletkezett antibiotikumot a fermentléből elkülönítjük. Kísérleteinkben a nisztatin mennyiségi meghatározását spektrofotometriásán, a nisztatinnak az ultraibolya fényben mérhető elnyelési maximumai alapján határozzuk meg /Analytical Profiles of Drug Substances, 6. kötet, Academic Press, 1977/ illetve az Amerikai Egyesült Államok gyógyszerkönyvének XX. kiadása alapján, Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 teszt-organizmussal. A példákban bemutatjuk az új Streptomyces noursei ssp. albidus törzsek fermentációjának, a gyártási eljárásnak a részleteit, anélkül, hogy ezzel a találmányunkat korlátozni akarnánk. 1. példa A Streptomyces noursei ssp. albidus NX jelzésű törzs mélyhütve /-15°C-on/ tárolt spóraszuszpenziójának 2ml-ével beoltjuk a következő összetételű inokulum táptalajt: 1 kukoricaliszt 30 g kukoricalekvár 5 g ammóniumnitrát 4 g kalciumkarbonát 10 g nátriumklorid 2 g kálium-dihidrogénfoszfát 1 g csapvíz 1000 ml pH: 6,2-6,4/150 ml-es Erlenmeyer lombikban 25-25 ml táptalaj/. Az oltóanyag készítést 2 napig folytatjuk 28° C-on,rázóasztalon /400 fordulat/perc, 2,54 cm lökethossz/. A kifejlődött tenyészetből /2,5-2,5 ml/ beoltjuk a következő összetételű fermentációs táptalajt: glükóz 75 g kukoricalekvár 5 g ammóniumnitrát 8 g szójaliszt 18 g kalciumkarbonát 7 g csapvíz 1000 ml pH: 6,1-6,3 /150 ml-es Erlenmeyer lombikokban, 25-25 ml táptalaj/. A fermentációt 28°C-on végezzük, rázóasztalon /400 fordulat/perc, %54 cm lökethossz/, 6 napig. A fermentáció befejezésekor meghatároztuk a kapott fermentlé antifungális hatású antibiotikum tartalmát, a fentiekben leírt biológiai • és kémiai módszerekkel. Egyrészt megvizsgáltuk a fermentlevet a nisztatin meghatározására szolgáló speciális mikroorganizmussal, a Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 teszt-organizmussal, az USA gyógyszerkönyv XX. kiadása előírásainak megfelelő biológiai módszerrel. Másrészt kémiai vizsgálatot is végeztünk a fermentlével, a G. W. Michel által leírt módszerrel/Ánalytical Profiles of Drug Substances, 6. kötet, Academic Press, 1977. pp. 390- 392/. Eszerint spetrofotometriásan, ultraibolya fényben mértük az elnyelési maximumokat, autentikus nisztatin standard mellett. A biológiai és a kémiai módszerrel végzett vizsgálatok egyaránt azt mutatják, hogy a fermentlében keletkezett antibiotikum nisztatin, a fermentlé nisztatin tartalma pedig: 62500 E/ml. 2. példa Mindenben az előző példa szerint járunk el, kivéve, hogy az inokulum táptalajt a Streptomyces noursei ssp. albidus NXO-9 jelű törzs mélyhütve /-15°C-on/tárolt spóraszuszpenziójának 2 ml-ével oltjuk be. Az előző példában leírt biológiai és kémiai vizsgálatokat elvégezve azt találtuk, hogy a fermentlé nisztatin tartalma 78400 E/ml. 3. példa A Steptomyces noursei ssp. albidus NXO-9 jelű törzzsel az 1. példa szerinti inokulumot állítunk elő / de 500 ml-es Erlenmeyer lombikban 100 ml-t /sa kifejlődött tenyészet 1 ml-ét beoltjuk a hasonló összetételű, 8 liter táptalajba /14 literes üvegfermentorba/. Az oltóanyag készítés paraméterei: hőmérséklet 28°C, levegőztetés 6 liter/perc, keverő fordulatszám 600/perc, időtartam 26 óra. Habzásgátlóként — szükség szerint — pálmaolajat használunk. A kifejlődött oltóanyag 800 ml-ét beoltjuk 8 liter fermentációs táptalajba /14 literes üvegfermentorba/, a táptalaj összetétele azonos az 1. példában megadottal. A fermentációt 6 napig, 28°C-os, 8 liter/perc levegőztetés és 600 fordulat/perc kevertetés mellett folytatjuk le, Habzásgátlóként — szükség szerint — pálmaolajat használunk. A fermentáció végén az 1. példában leírt biológiai és kémiai vizsgálatokat elvégezve azt találtuk, hogy a fermentlé nisztatin tartalma 145700 E/ml. 4. példa A Spreptomyces noursei ssp. albidus NXO-9 jelű törzzsel a 3. példa szerinti inokulumot állítjuk elő s a kifejlődött tenyészetet 1 ml-ét beoltjuk a hasonló összetételű, 8 1 táptalajba /14 1-es üvegfermentorban/.Az oltóanyag készítését a 3. példa szerint végezzük, majd a kifejlődött oltóanyagot beoltjuk 8 1, a következő összetételű fermentációs táptalajba: 2 szójaliszt 64 g kukoricaliszt 560 g ammóniumnitrát 36 g kalciumkarbonát 40 g nátriumklorid 16 g trinátriumfoszfát 3,2 g pálmaolaj 32 g víz 8000. rii Az összeállított táptalajban, keverés közben, 800 mg alfa-amilázzal, 80°C-on /10 percig/ elfolyósítjuk a keményítőt, majd 60 percig 122—123°C-on sterilezzük. A fermentációt 5 napig, 30°C-on, 8 1/perc levegőztetés és 600 fordulat/perc kevertetés mellett folytatjuk le. Habzásgátlóként — szükség szerint — pál-5 19305 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
