193039. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-21978C ciklusos peptid N-szubsztituált származékainak előállítására
193039 maximumok 223 nm (e 41,482) és 260 nm (e 8,687) (g) Elektrometrikus titrálás (66 % vizes DMF): 4 titrálható csoport van jelen, melyeknek pKa értéke körülbelül 5,2; 6,7; 8,5 és 11,1 (kezdeti pH 6,12). 2. preparálás A-21978C mag alternatív előállítása Az A-21978C magot az 1. preparálásban leírt eljárás szerint állítjuk elő, kivéve bizonyos változtatásokat a B. fejezetben. Az A. utahensis tenyészetet először mintegy 48 óráig inkubáljuk; a szubsztrát félig tisztított A-21978C komplex (50 g); a szubsztrát hozzáadása után az inkubálási idő körülbelül 16 óra. A szürtlevet 3,1 liter HP-20 gyantát tartalmazó oszlopon bocsátjuk át. Az oszlopot 10 térfogat vízzel mossuk, majd víz/acetonitril (95:5) eleggyel eluáljuk. Az elúciót az 1. preparálásban leírtak szerint detektáljuk. 24 liter összegyűjtése után az eluenst kicseréljük víz/acetonitril (9:1) elegyre. A magot tartalmazó frakciókat egyesítjük, az acetonitril eltávolítása céljából vákuumban bepároljuk és gyorshűtéssel szárítjuk. 24,3 g félig tisztított A-21978C magot kapunk. E félig tisztított magot (24,3 g) vízben (400 ml) oldjuk. Az oldatot 0,2 % ecetsavat és 0,8 % piridint tartalmazó víz/metanol/acetonitril (8:1:1) eleggyel készült 3,33 liter szilíkagél [Quantum LP-1|/C,8 töltetet tartalmazó 4,7 x 192 cm-es acéloszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopot a fenti oldószerrel körülbelül 13750 kPa nyomáson eluáljuk, 350 ml-es frakciókat gyűjtve. Az elúciót 280 nm-nél UV monitorral detektáljuk. A magot tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószereket vákuumban lepároljuk és a maradékot gyorshűtéssel szárítjuk. 14 g nagytisztaságú A-21978C magot kapunk. 3. preparálás N0r„-t-BOC-A-21978C C2 és C3 faktorok előállítása A-21978C C2 és C3 faktorok keverékét (10 g) (előállítva a 4,208,403 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás szerint) vízben (50 ml) oldjuk szonikálás közben (200 mg per ml). Az oldat pH-ját 4,05-ről 9,5-re állítjuk be 5n nátrium-hidroxid-oldat (3,6 ml) segítségével. Di-terc-butil-dikarbonátot (3,0 ml) adunk hozzá és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 2 óráig keverjük-. Az elegy pH-ját 9,5-ön tartjuk 5n nátrium-hidroxid-oldat kézi hozzáadásával (6,5 ml lúghozzáadás 2 óra alatt). A reakciót időnként szilikagél TLC-vel ellenőrizzük acetonitril/víz (7:3 és 8:2) oldószerrendszert használva és UV fényben detektálva. Körülbelül 10 perc múlva az oldat gyorsan megzavarosodik és a lúgfogyasztás emelkedik. 30 perc múlva csökken a zavarosodás sebessége és a lúgfogyasztás üteme, a reakció végét jelezve. Ennek ellenére a reakciót még 90 percig 13 folytatjuk a teljes átalakulás biztosítása céljából. 2 órai reagáltatás után a képződött anyagot azonnal liofilizáljuk; 12,7 g. N<?,n-t-BOC-A-21978C C2 és C3 faktort kapunk. Hasonló eljárást alkalmazva két 10 g-os és egy 30 g-os reakciót is indítunk. Ezeknél a reakcióidő csak 40 perc. A két 10 g-os kísérletből 11,9, illetve 12,1 g terméket kapunk. A 3C g-os reakció .35,4 g terméket eredményez. 4 Preparálás A-21978C N^-t-BOC mag előállítása A. A, utahensis fermentációja Az A. utahensis fermentációját az 1. préparées A. fejezetében leírtak szerint hajtjuk végre, ferde A. táptalajt és I. szaporító táptalajt használva és a szaporító táptalajt mintegy 66 óráig inkubálva. B. No^-t-BOC komplex dezacilezése Az A-21978C N^-t-BOC komplexet ( 1185g nyers szubsztrát, mely körülbelül .176 g A-21978C komplexet tartalmaz) hozzáadjuk a fermentációs közeghez. A dezacilezést az 1. preparálás B. fejezetében leírtak szerint hajtjuk végre. HPLC elemzéssel kimutatva a dezacilezés körülbelül 24 óra alatt teljes. C. A-21978C N^-t-BOC mag izolálása A B. fejezetben leírtak szerint kapott fermentlevet (100 liter) szűrési segédanyaggal (Hyflo Super-Cel) átszűrjük. A szűrletet 7,5 liter gyantát (DIAION) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át; az oszlopot vízzel (38 liter) mossuk. Az elúciót szilikagél/C,8 HPLC-vel ellenőrizzük 254 nm hullámhosszon, UV detektálással. Kevés mag a mosófolyadékkal eluálódik. A magot ezután a következő víz/acetonitril elegyekkel eluáljuk: (95:5) - 40 liter; (9:1) - 40 liter és (85:15) - 100 liter. A magot tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk és gyorshűtéssel szárítjuk. 298,5 g félig tisztított A-21978C NVn-t-BOC magot kapunk. D. \z A-21978C N»*-t-BOC mag tisztítása A C. fejezetben leírtak szerint kapott, félig tisztított A-21978C Nev„-t-BOC magot (30 g) 0,2 % ecetsavat és 0,8 % piridint tartalmazó víz/acetonitril (9:1) elegyben (75 ml) oldjuk. Az oldatot 3,33 liter szilikagél IQuantum LP-1]/C18 töltetet tartalmazó, a fenti - oldószerrendszerrel kiegyensúlyozott 4,7 x 192 cm-es acéloszlopra visszük fel. Az oszlopot nyomás alatt 0,2 % ecetsavat és 0,8 % piridint tartalmazó víz/acetonitril/metanol (80:15:5) eleggyel eluáljuk. 350 ml-es frakciókat gyűjtünk,és a terméket 200 nm-nél UV monitorral detektáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószer eltávolítása céljából vákuumban bepároljuk, és gyorshűtéssel szárítjuk. 18,4 g tisztított A-21978C Nom-t-BOC magot kapunk. Az A-21978C Nom-t-BOC mag jellemzői a kövekezők: (a) Alak: fehér amorf szilárd anyag, amely rövidhullámú UV fényben fluoreszkál (l>) Tapasztalati képlet: C67H9INI7027 (<) Molekulasúly: 1565 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8.
