193039. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-21978C ciklusos peptid N-szubsztituált származékainak előállítására
193039 juk 5 cm átmérőjű ív körül percenként 250 forgást végző rázógépen. A fentiek szerint előállított, inkubátt második fokozatú vegetatív táptalajjal (80 ml) beoltunk 10 liter steril szaporító táptalajt, melynek összetétele az alábbiak egyike: 1. táptalaj 11 Alkotórészek Mennyiség (g per 1) Földimogyoróliszt 10,0 Oldható hús-pepton 5,0 Szacharóz 20,0 kh2po4 0,5 k2hpo4 1,2 MgS04.7H2o 0,25 Csapvíz 1 literig 121°C-on 45 percig mintegy 110-124 kPa nyomás alatt végzett autoklávozás után a táptalaj pH-ja körülbelül 6,9. II. táptalaj Alkotórészek Mennyiség (g per 1) Szacharóz 30,0 Pepton 5,0 k2hpo4 1,0 KCI 0,5 MgS04.7H20 0,5 FeS04.7H20 0,002 Ion mentesített víz 1 literig A pH-t HCl-val 7,0-re állítjuk be; autoklávozás után a pH körülbelül 7,0. III. táptalaj Alkotórészek Mennyiség (g per 1) Glükóz 20,0 NH4Cl 3,0 Na2S04 2,0 ZnCI2 0,019 MgCI2.6H20 0,304 FeCI3.6H20 0,062 MnCl2.4H20 0,035 CuC12.2H20 0,005 CaC03 6,0 kh2po4* 0,67 Csapvíz 1 literig *Külön sterilizálva és fertőző anyagoktól mentesen hozzáadva Végső pH körülbelül 6,6. A beoltott szaporító táptalaj fermentációját 14 literes fermentorban mintegy 30°C-on körülbelül 66 óráig folytatjuk. A fermentációs közeget szokásos keverőkkel körülbelül 600 ford/perc sebességgel keverjük és steril levegővel levegőztetjük úgy, hogy az oldott oxigén szintjét 30%-os levegőtelítés felett tartsuk légköri nyomáson. B. Az A-21978C.dezacilezése Az A. utahensis fermentációját az A. fejezetben leírtak szerint hajtjuk végre ferde A. táptalajt és I. szaporító táptalajt használva, és a szaporító táptalajt mintegy 67 óráig inkubálva. A fermentációs közeghez nyers A-21978C komplexet adunk (100 g) (előállítva a 4,208,403 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint). Az A-21978C komplex dezacilezését Micrococcus luteus-szal.végzett próba segítségével követjük. A fermentációt teljes dezacileződésig folytatjuk; ezt a M. luteus-szal szembeni aktivitás eltűnése jelzi (körülbelül 24 óra). C. Az A-21978C mag izolálása A B. fejezetben leírtak szerint kapott teljes fermentlevet (20 liter) szűrési segédanyaggal. (Hyflo Super-Cel, Johns Manville Corp.) átszűrjük. A micélium eltávolítása után a szűrtlevet 1,5 liter HP-20 gyantát (DIAION High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubushi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át. A kapott effluenst ejöntjük. Az oszlopot ionmentesített vízzel (10 liter) mossuk a szü.rtlé maradékának eltávolítása céljából. A mosófolyadékot elöntjük. Ezután az oszlopot 10-10 liter víz/acetonitril elegyekkel (95:5, 9:1 és 4:1) eluáljuk, 1 literes frakciókat gyűjtve. Az elúciót papírkromatográfiával ellenőrizzük, n-butanol/piridin/ecetsav/víz (15: : 10:3:12) oldószerrendszert használva és a vegyületeket UV fluoreszcenciával detektálva. E rendszerben az A-21978C faktorok R/ értéke körülbelül 0,56 és az A-21978C mag Rf-értéke körülbelül 0,32. A termék analitikai HPLC-vel is ellenőrizhető, fordított fázisú szilikagél/C18 adszorbenst és 0,1 % ammonium - acetátot tartalmazó víz/metanol (3:1) oldószerrendszert használva, a magot UV monitorral 254 nm hullámhossznál detektálva. A magot tartalmazó frakciókat egyesítve, az acetonitrilt vákuumban lepárolva és a maradékot gyorshűtéses fagyasztással szárítva 40,6 g félig tisztított A-21978C magot kapunk. D. Az A-21978C mag tisztítása A C. fejezetben leírtak szerint kapott félig tisztított magot (15 g) 0,2 % ecetsavat és 0,8 % piridint tartalmazó 75 ml víz/metanol/acetonitril (82:10:8) elegyben oldjuk. Az oldatot 3,33 liter szi 1 ikagé 1 /C,8 (Quantum LP-I, Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield, N.J.07006) töltetet tartalmazó, 4,7 x 192 cm-es oszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopot a fenti oldószerrendszerrel eluáljuk. 350 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az elválasztást 280 nm hullámhosszon UV detektorral detektáljuk. A magot tartalmazó frakciókat egyesítve, az oldószereket vákuumban lepárolva és gyorshűtéssel szárítva 5,2 g tisztított A-21978C magot kapunk. E. Az A-21978C mag jellemzői Az A-21978C mag jellemzői a következők: (a) Alak: fehér amorf szilárd anyag, mely rövidhullámú UV fényben fluoreszkál (b) Tapasztalati képlet: C62H82N|6026 (c) Molekulasúly: 1466 (d) Oldhatóság: vízben oldódik (e) Infravörös abszorpciós spektrum (KBr) maximumok: 3300 (széles), 3042 (gyenge), 2909 (gyenge), 1655 (erős), 1530 /erős/, 1451 /gyenge/, 1399 /közepes/, 1222 /közepes/, 1165 /gyenge/, 1063 /gyenge/ és 758 /közepes - gyenge/ cm"1 (f) UV abszorpciós spektrum (metanol) 12 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
