193031. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-triptofán előállítására
193031 mikroorganizmusokat víz alatt, levegőztetéssel egy olyan táptalajon tenyésztünk, amely szénforrásként szénhidrátokat, nitrogén- és foszforforrásokat, növekedési anyagokat és a szükséges ásványi sókat tartalmazza, majd ezekután a fermentléből a végterméket ioncsere segítségével és kristályosítással választjuk el—úgy érjük el, hogy bacillus subtilis fajú mikroorganizmusok közül a bacillus subtilis VN11 genetika-15 törzset alkalmazzuk és a fermentáció alatt koncentrált pótlólagos tápanyagot adagolunk a táptalajhoz, amely szénszervetlen nitrogén- és növekedési anyagforrásokat tartalmaz olyan mennyiségben, amely biztosítja a táptalajban feloldott oxigén koncentrációjának 10—40% között tartását. A találmány lényege az, hogy az új bacillus subtilis VN11 genetika-15 törzset egy szénás nitrogénforrásokat, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon, levegőztetéssel, egy tápanyagkeveréknek a tenyésztés közbeni adagolásával tenyésztünk, majd a fermentléből a keletkezett L-triptofánt ioncserélő eljárással elválasztjuk. Szénforrásként technikai cukrot alkalmazunk. A növekedési fázis végső szakaszában, a fermentáció kezdete után 12—30 órával, a fermentorba egy szén- és nitrogénforrást, valamint növekedési anyagot tartalmazó tápanyagpótlást adagolunk olymódon, hogy az oldott oxigén koncentrációja ne lépje túl a 40%-ot. Az új VNI1 genetika-15 törzs alkalmazása egy tápanyagnak a fermentáció közbeni adagolásával együtt lehetővé teszi, hogy az L-triptofán bioszintézisének sebessége megnövekedjék és a táptalajban való felhalmozódásának a szintje, cukor (illetve szaccharóz) szénforrás alkalmazása esetén, megemelkedjék. 48 órát, 37°C-on végzett fermentáció után az L-triptofán felhalmozódásának szintje a fermentlében 10,8 g/1. A triptofán elválasztására egy enyhén bázikus kondenzációs típusú anioncserélőt és egy H-formájú szulfokationcserélőt alkalmazunk. A kristályos triptofán kitermelése 65-75%. Az új bacillus subtilis VN11 genetika-15 törzset az ismert bacillus subtilis Gen-3557 törzsből lépcsőzetes szelekcióval nyertük olymódon, hogy a sejt szuszpenziót egy N-metil-N-nitrozo-N-guanidin mutagénfaktorral kezeltük (a koncentráció 200 mg/ml és az expozíció 20 perc) és azokat a mutánsokat kinyertük, amelyek szerkezeti aminosavanalogonokkal szemben rezisztensek. Az első szelekciós lépésben a mutagénnel kezelt Gen-3557 törzs sejtjeit egy olyan minimális táptalajra oltottuk, amely 5 mg/ml koncentrációban egy hisztidin-l-L-metilhisztidin-analogont tartalmaz. A tenyésztett rezisztens kolóniák közül a 924-es törzset választottuk ki, amelynek a sejtjeit a mutagénnel való kezelés után egy olyan táptalajra oltottuk, amely triptofánnak, fenilalaninnak és tirozin-analogonnak a következő keverékét tartalmazza: 5-fluor-triptofán 3 (2 mg/ml), íenilalanin-hidroxamát (0,5 mg/ /ml) és tirozinhidroxamát (2,5 mg/ml). Azok közül a kolóniák közül, amelyek a fenti aminosav-analogonok keverékére rezisztensek, egy 22 - 13-as törzset választottunk. A 22-13-as törzs sejtjeit újra mutagénnel kezeltük és egy olyan táptalajra oltottuk, amely ugyanazoknak az aminosav-analogonoknak a keverékét tartalmazza, most azonban 2,5 mg/ml, 0,5 mg/ml,illetve 2,5 mg/ml koncentrációban. Azok közül a kolóniák közül, amelyek a fenti analogonok keverékével szemben rezisztensek, a VNI1 genetika-15 törzset választottuk ki. Az 1. táblázatban összehasonlító adatok vannak megadva arról, hogy milyen a triptofán felhalmozódási szintje lombikban, szaccharózos táptalajon, a kiindulási Gen-3557-es törzzsel és az új VNII genetika-15 törzzsel végzett fermentáció során. A megadott feltételek között az új VN1! genetika-15 törzzsel a triptofán kitermelése a fermentáció végén mintegy 45% - ka I haladja meg a kiindulási törzzsel elért aminosav kitermelést. A VNII genetika-15 törzzsel az L-triptofán felhalmozódásának magas szintje (9- -11 g/1) érhető et 48 óra alatt, fermentálóban történő tenyésztéssel, egy tápanyagnak a fermentáció alatt, a javasolt eljárás szerint történő adagolásával. A bacillus subtilis VN1I genetika-15 törzset a „VN1I genetika" intézetnek az ipari mikroorganizmusok központi múzeumában raktározzák, ahol CMPMV—2306 számon tárolják. A bacillus subtilis VNII genetika-15 törzsnek a következő kultúrmorfológiai jellemzői vannak. Grampozitív, spóraképző pálcikák, hús-pepton-agaron a telepek 24 órás inkubáció után, 37°C-on 4-5 mm átmérőt érnek el, teljesek, kör alakúak, recézett széllel, a felületük sima, a szélén gyenge sugárirányú, a közepén koncentrikus rajzolatokkal, a színük szürkés-fehér. Hús-pepton-agaron végzett vonalszerű oltás 24 órás, 37°C-on történő inkubáció után jelentős növekedést mutat, a vonal széles, finoman cakkozott szélű, sajátos szagú, olajos konzisztenciájú, a színe szürkés-fehér. A hús-pepton-bouillonon történő növekedést egy napos, 37°C-on történő inkubáció után a közeg jelentős, filmképződés nélküli zavarosodása jellemzi, a szag sajátos, az üledék kevés és felrázás esetén sűrűn folyó. Agarizált ásványi Spitzeisen-táptalajon, glükózzal a telepek 3 napos, 37°C-on végzett inkubáció után 1,5-2,0 mm-es átmérőt érnek el, teljesek, kör alakúak, sima, csillogó felületűek, színük piszkosfehér, szerkezetük homogén. A folyékony ásványi Spitzeisen-táptalajon történő növekedést (24 órás inkubáció, 37°C-on, rázóberendezésben) a közeg gyenge sugáralakú zavarosodása jellemzi. A VNII genetika-15 törzs növekedését folyékony, illet-4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
