193031. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-triptofán előállítására
ve agarizált minimális táptalajon az L-fenilalanin, a kiindulási Gen-3557-es törzstől eltérően, nem stimulálja. Az eljárást a következőképpen valósítjuk meg. A bacillus subtilis VN11 genetika-15 törzset 24 óráig agarizált táptalajon (hús-pepton-agar) tenyésztjük, majd steril, szén-, nitrogén- és növekedési anyagforrásokat, valamint a szükséges ásványi sókat tartalmazó táptalajra oltjuk át őket lombikokba, és 18 - 24 órán át tenyésztjük egy olyan rázóberendezésben, amely 28 - 30°C-on, aszeptikus körülmények között elegendő levegőztetést biztosít. Az így nyert oltóanyagot I — 10%-os mennyiségben egy fermentálóba adjuk, amelyben olyan steril táptalaj van, amely szén-, nitrogén- és növekedési anyagíorrásokat, valamint a szükséges ásványi sókat tartalmazza. Szénforrásként szaccharózt, illetve szaccharózt tartalmazó anyagokat, például technikai cukrot, nitrogéníorrásként karbamidot, növekedési anyagforrásként kukoricaextraktumot használunk. A fermentációs berendezés az oldott oxigén koncentrációját megadó berendezéssel, levegőztető, keverő, a hőmérsékletet tartó, próbák levételét és a fermentáció során tápanyag hozzáadását lehetővé tevő berendezésekkel van ellátva. A fermentáció 48 órán át, 35 - 40°C hőmérsékleten, 6 - 8 pH értéken folyamatos levegőztetéssel és keveréssel történik. A fermentáció elejét, a biomassza intenzív növekedése miatt, az oldott oxigén koncentrációja lecsökken, azután elkezd nőni. 12-30 órával a fermentáció kezdete után, mikor az oldott oxigén koncentrációja (p02) a levegővel való telítés következtében 40% fölé emelkedik, a fermentálóközegbe, atmoszférikus nyomáson egy koncentrált adalékot adunk, amely szén-, nitrogén- és növekedési anyagforrásokat tartalmaz. Az adalékot úgy vezetjük be, hogy az oldott oxigén koncentrációja a 40% p02-t ne lépje túl. 48 órás fermentáció után az L-triptofán koncentrációja a tápoldatban eléri a 9 - 11 g/l-t. Az így nyert tápoldatot egymás után mésztejjel és kénsavval kezeljük és szűréssel, illetve centrifugálással a biomasszát elválasztjuk. Ezután következik a kristályos L-triptofán kinyerése, ismert eljárással, az L-triptofánnak egy enyhén bázikus kondenzációtípusú anjoncserélőn és egy H-formájú szulfokationcserélőn történő kezelése révén. 1. példa (kontrollpélda) Oltóanyag készítése céljából a bacillus subtilis VN11 genetika-15 törzs napostelepét, amelyet egy agarizált táptalajon (hús-pepton-agar) tenyésztettünk, átoltjuk olyan 750 ml-es lombikokba, amelyek 40 ml sterii oltóközeget tartalmaznak. Az oltóközegnek a következő az összetétele (%): 5 technikai cukor 5,0 kukoricaextraktum (a technikai súly alapján) 2,0 KH2P04 0,06 K2HP04 0,14 pH = 7,0 - 7,2 A táptalajt 0,8 atmoszférán 30 percig sterilezzük. Az oltóanyagot 18 - 20 órán át, egy rázóberendezésben (200 - 300 U/perc) 28 - 30 °C-on tenyésztjük. A íermentálóközeg beoltására az oltóanyagot 5%-os mennyiségben adagoljuk. 6 kező (%): technikai cukor 10,0 kukoricaextraktum (technikai súly alapján) 3,0 KH2PO„ 0,06 K2HP04 0.14 MgS04.7H20 0,1 NaCl 0,015 karbamid 0,5 pH = 7 - 7,2 A fermentációs közeget, a karbamid nélkül, 0,8 atmoszférán 30 percig sterilezzük. A karbamidot 25%-os oldat formájában külön sterilezzük 0,5xl05 Pa nyomáson 30 percig és az alaptáptalajhoz az oltás előtt hozzáadjuk. A fermentáció víz alatti tenyésztéssel történik 20 ml táptalajt tartalmazó Erlenmeyer lombikokban (250 ml-es térfogatúak, két viszszaverő lappal ellátva), rázóberendezésben (400 fordulatszám/perc), 37°C hőmérsékleten, 48 órán át. 48 óra alatt az L-triptofán a tápoldatban 7,5 g/1-es mennyiségben halmozódik fel. 2. példa A törzs előállítása, az oltó és a fermentáló közeg összetétele ugyanaz, mint az 1. példában. Az 1. példában leírt fermentálásí eljárástól eltérően a tenyésztést pótlólagos tápanyagnak, a táptalajban feloldott oxigén mennyiségétől függő, kis részletekben történő hozzáadagolásával végezzük. A pótlólagos tápanyagkeverék összetétele a következő (%): technikai cukor 50,0 kukoricaextraktum 20,0 karbamid 2,25 pH = 7,2 - 7,3 A pótlólagos tápanyagkeveréket 0,8 atmoszférán 30 percig sterilezzük. A karbamidot külön, 25%-os oldat formájában, 0,5 atmoszférán, 30 percig sterilezzük. A fermentáció folyamán a feloldott oxigén mennyisége (p02) a táptalajban nullára csökken, ezután emelkedik. A p02-nek 40%-ra történő felemelkedésekor olyan mennyiségű pótlólagos tápanyagot adunk hozzá, amely előidézi a p02 csökkenését. A pótlólagos tápanyag hozzáadását a fermentáció 19 - 30. órájában kezdjük meg. A felhasznált pótlólagos tápanyag térfogata 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
