192993. lajstromszámú szabadalom • Eljárás albicidin antibiotikum előállítására
3 192993 4 A találmány tárgya eljárás antibiotikus anyag, közelebbről a Xanthomonas albiiineans vizes tápközegben való tenyésztése útján termelődő, széles spektrumú antibiotikum előállítására. A cukornád (Saccharum of/icinarium L.) levélfoltosság-beteg ségének tanulmányozása során azt találtuk, hogy a megbetegedést okozó, xilémet megtámadó Xanthomonas albiiineans (Ashby) Dowson mikroorganizmus valószínűleg diffundálni képes fitotoxint termel. Klorózist okozó X. albiiineans (Ashby) Dowson LS2 törzset tenyésztettünk (Hawaii-ból származó, megbetegedett cukornád eredeti izolátumét) a fitotoxin kimutatása céljából. Bár ezideig nem írták le, hogy a Xanthomonas nemzetség mikróbaellenes anyagokat termelne, antibiotikus anyagok keverékét tudtuk izolálni, és a keverék fő baktériumellenes komponensét izolálni és tisztítani tudtuk. Azt találtuk, hogy ez az új antibiotikum - melyet önkényesen albicidinnek neveztünk el - nagy számú emberi és állati kórokozó mikroorganizmus növekedését gátolja. A széles spektrumú albicidin antibiotikumot a Xanthomonas albiiineans klorózist okozó törzsének vizes tápközegben való tenyésztése útján termeljük, a tenyésztést addig folytatva, amíg jelentős mennyiségű antibiotikum képződik. Előnyösen stacioner fázisban levő kultúrát tenyésztünk a maximális antibiotikum-termelés elérése céljából. A sejteket elválasztjuk az antibiotikumot tartalmazó tápközegből, az antibiotikumot akrilészter polimer gyantán abazorbeáltatjuk és arról metanollal eluáljuk. Az antibiotikumot tartalmazó eluátumot koncentráljuk, acelonnal hígítjuk és hidegben tartjuk az inaktív anyag kicsapódása céljából. Az inaktív anyagot elválasztjuk, és az antibiotikumot tartalmazó folyékony fázist gélszűréssel és nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) tovább tisztítjuk. Az albicidint fehér kristályos vegyület alakjában izoláljuk. A mellékelt rajzok közül az 1. ábra az albicidin metanolban, metanolos kálium-hidroxid-oldatban és vízben (pH 7) felvett UV- abszorpciós spektrumát mutatja. A 2. ábra az albicidin HPLC elúciós profilját mutatja Hamilton PRP-1 oszlop, és a 3. ábra az albicidin elúciós profilját mutatja Beckman ODS oszlop alkalmazása esetén. A találmány szerint előállított albicidin antibiotikum fehér kristályos vegyület, amely kevéssé oldódik vízben és acetonitrilben, oldódik poláris szerves oldószerekben; és lényegében oldhatatlan apoláris szerves oldószerekben; molekulasúlya körülbelül 842; protonmágneses rezonancia spektruma az alábbi: lH-NMR (DMSO-ds, 300 MHz); é 11,567 (1H, széles s), 11,178 (1H, s), 10,597 (1H, s), 10,131 (1H, a), 9,802 (1H, széles s), 9,719 (1H, s), 9,042 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,039 (1H, d J=8,8 Hz), 8,009 (1H, d, J=8,8 Hz), 7,939 (1H, d, J=8,9 Hz), 7,870 (1H, d, J=8,9 Hz), 7,828 (1H, d, J=8,8 Hz), 7,811 (1H, d, J=8,8 Hz). 7,600 ilH, széles d, J=8,8 Hz), 7,372 (211, d, J=8,8 Hz) 7,287 (1H, széles q, J=l,2 Hz), 6,858 (2H, d J=8,8 Hz), 5,003 (1H, széleB td J=8,5; 7,8 és 5,6 Hz), 3,931 (3H, s), 3,795 (3H, a), 3,165 (1H, dd, H=-16,9 és 5,6 Hz), 3,097 <1H, dd, J=-16,9 és 8,5 Hz), 2,136 (3H, d, J=l,2 Hz); szénmágneses rezonancia spektruma a következő; 13C-NMR (DMSO-dí, 75 MHz): S 168,89 (s), 168, 19 (s), 166,17 (s), 164,86 (s), 163,30, (s), 157,52 (s), 154,49 (s), 149,72 (s), 142,70 (s), 141,86 (s), H0,26 (s), 137,76 (s), 136,15 (s), 135,90 (s), 133,92 (d), 131,31 (d, 2C), 129,51 (s), 128,99 (s), 128,80 (d), 128,36 (d), 127,65 (s), 126,55 (s), 125,70 (d), 125,48 (d), 119,14 (d), 118,95 (d), 118,22 (s), 116,25 (s), 115,39 (d, 2C), 114,94 (d), 110,20 (d), 60,56 (q), 60,22 (q), 50,62 (d), 20,03 (t), 14,57 (q); ultraibolya abszorpciós sprektruma az alábbi; Xmax 308 nm és „váll" 275 nm-nél vizes oldatban (pH 7, 0,01M trisz-HCl puffer), Xmax 213 nm és 308 nm metanolban (10 meg per ml), El*ic»=8xlOJ, Xmax 320 nm és „váll” 350 nm-nél metanolos 0,06n kélium-hidroxid-oldatban; 37 °C-on 3 h-ig stabil mintegy 50 pg/inl koncentrációjú pronázzal (proteolitikus enzim) szemben. Az albicidin nem-peptid antibiotikum, amely poláris szerves oldószerekben mint metanolban, etanolban, letrahidrofuránban, dimetil-acetamidban, dimetil-formamidban, 95% acetonban és dimetil-szulfoxidban oldódik. Kevéssé oldódik vízben és acetonitrilben és lényegileg oldhatatlan apoláris szerves oldószerekben. Az albicidin a spektrum ultraibolya tartományának sugárzását nyeli el. Ultraibolya abszorpciós spektruma az 1. ábrán látható. Metanolban (10 meg per ml) a spektrum abszorpciós maximumokat mutat 213 és 308 nm-nél, E1*ici«=8xl0,'0,06n metanolos kálium-hidroxid-oldat hozzáadásakor a 308 nm-es maximum eltolódik 320 nm-re és 350 nm közelében „váll" mutatható ki. Vizes oldatban (pH 7, 0,01M trisz-HCl purffer) a spektrumban abszorpciós maximum van 308 nm-nél és 275 rim-nél „váll" látható. Az albicidin fentiek szerint kapott UC-NMR spektrumában minden jel egyetlen szénatomtól származik, hacsak másként nem jelezzük. Az albicidin molekulasúlya 842, tömegspektrometriával meghatározva. A gyors atombombázásoB (FAB) spektrum alapján (M+H)*=843, míg a térdeszorpciós tömegspektrum (FDMS) szerint (M+H)+=843 éB M/Z=79 9 (843-44), jelezve a karboxil csoport elvesztését. Az albicidin viszonylag satbil alacsony pH-nál és viszonylag instabil magas pH-nál, amint ezt baktériumellenes aktivitásának megtartása illetve elvesztése tükrözi. Például ha az albicidin vizes oldalát 100 °C-on tartjuk 30 percig, aktivitása nem csökken. 3 h 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
