192989. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fiziológiailag aktív hormon készítmények előállítására
8 192S89 9 Durham U.K. A h GH radioaktív jódozását laktoperoxidázzal végeztük, 80 x 10® cpm/g töménységig (Linde et. al: Anal. Biochem 107, 1980, 165-176). Az Ultrogel töltetű (LKB Ltd., Cambridge, UK) oszlopos kromatográfiás vizsgálat előtt a monomer 125J-hGH-t elválasztottuk az aggregált anyagtól. Az antitest-hormon komplexeket 1 órával az állatoknak való beadagolás előtt, az oldatok összekeverésével állítottuk elő. Azoknál a kísérleteknél, amelyeknél az injekciózást több héten keresztül végeztük, a komplexeket 1 hétre szükséges mennyiségben, egy tételben készítettük. Oldható extraktumot selyemmajom hypophlsisből készítettünk, a szövetet 0,05 mól nátrium-hidrogén-karbonátot tartalmazó 2 mmólos 8,6 pH-jú PMSF oldattal elkeverve, majd a kapott homogén!zátumot 10 000 g-vel 20 percig centrifugálva. A 20 ml-nyl felül— úszót használtuk a vizsgálatokhoz. Biológiai vizsgálatok A) példa hGH-EBOl komplexszel kezelt törpe egerek kumulatív súlygyarapodása Törpe egereket tenyésztettünk normál állatokból, amelyek dw génjükben heterozigóták, valamint heterozigóta nőstényegerekből és homozigóta, thyroxinnal kezelt törpe egerekből. A törpe egereket (súlyuk 9,1 ± 0,4 g) randomizáltan hat állatot tartalmazó vizsgálati csoportokba osztottuk és egy-egy csoportot kis ketrecekben helyeztünk el, majd 0,1 ml mennyiségű hormoninjekciókkal, szubkután, különböző időközönként kezeltük őket. A súlyukat megmértük a kezelés megkezdésekor, majd a későbbiekben különböző időközönként. A súlygyarapodást a rövididejű, ill. a kumulatív súlygyarapodást a több napon át tartó kísérleteknél a kezdeti súlyhoz viszonyított relatív értékkel (X) ill. a tiszta súlyértékkel (g) fejeztük ki. A farok hosszát Hughes és Tanner (Anatomy 106, 1970, 349-370) módszere szerint határoztuk meg. Három hetes kísérleti periódus alatt, a kontroll csak PBS-sel kezelt egerek relatív súlygyarapodása kb. 15X volt, míg a 10 jug hGH-val kezelt állatoknál ez az érték ugyanilyen idő alatt 22X volt, ugyanakkor a hGH-EB01 komplex-szel (amely 10 pg EB01 tartalmú) kezelt állatok kumulatív súlygyarapodása 34X volt, ami megfelel a csak hGH-val kezelt egereknél mért értékekhez viszonyított további 12X-os növekedésnek. Ha a komplexben a hGH mennyiségét 10 pg-ról 160 pg-ra emeltük, a súlygyarapodás 44X-ra növekedett. Az 1. ábrából látható, hogy a kezelt és kontroll csoport közötti különbség a 21 napos periódus alatt progreszszíven emelkedik. Míg a hGH-MAB komplex-szel kezelt állatoknál jelentős emelkedés mutatható ki 48 óra altt, a csak hGH-val kezelt csoport és a kontrollcsoport között 7 napig nem jelentkezett különbség. B) példa Növekedés fokozása EB01 F ab’ fragmenssel Annak érdekében, hogy meghatározzuk, hogy az EB01 antitest két értéküsége előfeltétele-e a növekedésfokozásnak, vizsgálatokat végeztünk EB01-F ab’ - hGH komplexek 35S04z" felvételre kifejtett hatására, törpe egereknél. Viszonylag szűk súlyhatárok között (7- -10 g) törpe egereket véletlenszerűen elosztottunk [Fisher, R.A. és Yates F. (ED): Statistical tables for biological, agricultural and medical research Oliver, Boyd, 1975], majd 24 órával az utolsó hormoninjekció után [Herbai G.: Acta Physiol. Scandinavica, 80, (1970), 470-491], 0,5 Ci/g testsúly mennyiségben ^SO^'-et adagoltunk injekció formájában. 20 óra elteltével az egereket megöltük, a bordavázat eltávolítottuk, 20 percre fövő vízbe helyeztük, egy éjszakán át telített nátrium-szulfáton szárítottuk, majd 2 órán át folyóvízben, majd 1 órán át desztillált vízben mostuk. Ezután a bordák csontos részeit a közeli porcok 1 mm-es rétegével levágtuk, meghagyva a sternumhoz kötődő bordai porcokat. Az összes lágy szövet eltávolítása után, az öt leghosszabb bordaporcot, amely közvetlenül a sternumhoz kötődik, mindkét oldalon elválasztottuk és állatonként külön összeraktuk. Az így kapott tíz bordaporc-készletet ezután szobahőmérsékleten egy éjszakán át szárítottuk, mértük, majd elvégeztük a “SO*2- meghatározás. A 35SCu2- felvételt hasadás/perc/mg borda egységben fejeztük ki. A szulfát-felvétel szintje EB01-el vagy EB01-F ab’-vel kézéit porcoknál nem különbözött jelentősen, összehasonlítva az azonos ABT» mennyiségű antitestek és fragmensek alkalmazásával (1. táblázat). A csak hGH jelenlétében mutatott növekedés azonban jelentősen kisebb volt, mint F ab’ - hGH esetében. Az F ab’ fragmens értékének növelésével azonban [egy .második", akár monoklón antitest (TC187) akár egy poliklón anti-egér lg antitest bevonásával] nem változott jelentősen a ^SCU2“ felvétel. Továbbá, a F ab’ fragmensek nem gátolják kompetitiven az EB01 antitest potencírozó hatását. Ekvlmoláris mennyiségű hGH és hCS hormonokkal és EB01 antitesttel készített komplexek szintén nem csökkentik az EB01 antitestek potencírozó hatásának mértékét. Ezek a komplexek feltehetőleg főleg hGH - EB01 - hCS fajtákat tartalmaznak, amelyek esetében várható volna az aktivitás csökkenése, ha a kétértéküség szükséges, mivel a hCS szomatotrop hatása csak 10X-a a hGH hatásának. Ez utóbbinak 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
