192971. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-51568 A-faktor és B-faktor antibiotikumok előállítására
27 192971 28 Diaion HP-20 oszlopra visszük, az oszlopot 200 ml vízzel mossuk és 100 ml 50%-os vizes metanollal eluálunk. A metanolos eluátumot szárazra pároljuk, a bepárlási maradókot kevés vízben oldjuk és 0,1 n vizes sósavval megsavanyítjuk. A savas oldatot liofilizáljuk. 25 mg tisztított A-51568 A-faktort nyerünk, melynek fizikai állandói megegyeznek a leírás bevezető részében megadottakkal. A B-faktor kinyeréséhez a- 3. példában leírtakat végezzük el, de a B. subtilisszel végzett mikrobiológiai vizsgálatok helyett nagynyomású folyadék kromatográfiai (HPLC) használunk a frakciók vizsgálatára. Erre azért van szükség, mert a mikrobiológiai módszerrel nem tudjuk megkülönböztetni az A- és B-faktort. A HPLC vizsgálatokkal az A- és B-faktort tartalmazó frakciók azonosíthatók és egymástól elválasztva gyűjthetők öszsze. A faktorok szerint egyesített frakciókat az előzőekben leírtak szerint sótalanítjuk, és így egy A-faktorban és egy B-faktorban gazdag termékhez jutunk. 4. példa Az A-51568 A- és B-faktor keverékének teljes fermentléből történő kinyeréséhez, a fermentlevet Hyflo Supercelen szűrjük keresztül. Miután a szőriét kémhatását 5 n sósavval pH 6,0-6,5-re állítottuk, Ionac X-236 gyantát (H+ formában) adunk hozzá (100 liter fermentléhez 4 liter gyantát), és a keveréket kevertetjük miközben az antibiotikum adszorbeálódik a gyantán. A felülúszót eldobjuk, és a gyantát vízzel mossuk (a gyanta térfogatának tízszeresével). A mosóvizet eldobjuk, és a gyantát oszlopra töltjük. Az oszlopot 0,1 n ammónium-hidroxidal eluáljuk (az oszloptérfogat ötszörösével). A 4 literes frakciókat rögtön semlegesítjük 5 n sósavval. Az antibiotikus aktivitást B.sublitesszel és HPLC-vel határozzuk meg. Az A-51568 A- és B-faktorok keverékét tartalmazó frakciókat összeöntjük, és Diaion HP-20 oszlopon sótalanitjuk. Az effluenst eldobjuk, és a gyantát 0,1 % H3PCU-et tartalmazó 5%-os izop rop il alkohollal eluáljuk. 500 ml-es frakciókat gyűjtünk, és vizsgáljuk ezek antibiotikus aktivitását. Az aktív frakciókat egyesítjük, töményitjük és liofilizáljuk. A nyert nyers termék 9596 A-51568 A-faktort és 5% A-51568 B-faktort tartalmaz. A termék további tisztításához és az A- és B-faktor egyidejű elválasztásához az A- és B-faktorok nyers keverékét vízben oldjuk és CM-Sephadex C-25 oszlopra visszük. Az oszlopot víz ^ 0,25 n ammónium-hidro-karbonát lineáris grádienssel eluáljuk. A frakciókat HPLC-vel vizsgáljuk, és az A-, illetve B-faktort tartalmazó frakciókat külön-külön egyesítjük. Az egyesített frakciókat sótalanítás céljából Diaion HP-20 gyanta oszlopokra visszük és az oszlopokat 0,1% H3PCü-et tartalmazó 5%-os izopropilalkohollal eluáljuk. A megfelelő frakciókat a HPLC vizsgálatoknak megfelelően egyesítjük. A két oldatot töményítjük és liofilizáljuk, A-51568 A-faktort, illetve B-faktort nyerve. 5. példa Az 1. példában leírt eljárást követjük vegetatív inokulum előállítására, azzal az eltéréssel, hogy a vegetatív inokulum táptalajának kémhatását sterilizálás után pH=6,6-ra állítjuk, és az inkubálást 46 órán át végezzük. Az előállított 250 ml-es Erlenmeyer-lombikokban levő tenyészetek 10-10 ml-ével kétszer 400 ml, fentiekkel azonos összetételű táptalajt inokulálunk. Ezeket a táptalajokat 2000 ml-es, szélesnyakú Erlenmeyer-lombikokban 30 °C hőmérsékleten, 51 órán át rázatjuk 2,5 cm kitérésű, 250 percenkénti fordulatszámú rázógépen. 110 I alábbi összetételű táptalajt 0,8% (800 ml) fentiekben előállított vegetatív inokulummal oltunk be. A termelésre szánt tenyészet táptalajának összetétele: SAG 471 (Union Carbide gyártmány) 0.2 g/l polipropilén-glikol (2000) 0.1 g/l burgonya-dextrin 30.0 g/l melasz 20.0 g/l Bacto-pepton (Difco) 7.0 g/l L-tirozin 1.0 g/l ionmentes vízzel 110 l-re töltjük fel. Az oldat kémhatása 5,5, amit 5 n nátrium-hidroxid-oldattal pH=7,0-ra állítunk be. A táptalajt 121 °C hőmérsékleten, 1-1,3 bar nyomáson sterilezőnk 45 percen keresztül. Sterilizálás után az oldat kémhatása: pH=6,2 A beoltott táptalajt 165 l-es fermentorban fermentáljuk 30 °C hőmérsékleten, 114 órán keresztül. A percenként átbuborékoltatoit levegő mennyisége a fermentlé térfogatának 0,125-szörose. A keverést a szokásos keverőberendezéssel végezzük, percenkénti 250-es fordulatszámmal. Az antibiotikus aktivitás a fermentlé felülúszójában található. Az antibiotikum menynyiségének mérésére a fermentlé mintákat 1000 g-n lecentrifugáljuk, és a leöntött felülúszót vizsgáljuk. A felülúszót pH=6,0 kémhatású foszfát-pufferrel hígítjuk, és mikrobiológiailag mérjük az aktivitást agar-lemezen, Micrococcus luteus ATCC 9341 mikroorganizmust használva. A fenti fermentációban nyert kétszer 110 I teljes fermentlevet (össztérfogata kb. 230 I) Hyflo-Supercel kovaföld szűrőanyaggal keverünk össze, és az elegyet 92 cm-es Sperry keretes szűrőn szűrjük. A 185 I szűrlet kémhatását 5 n sósav hozzáadásával 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
