192971. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-51568 A-faktor és B-faktor antibiotikumok előállítására
29 192971 30 pH=6,0-6,5-re állítjuk. Az A-51566 faktorokat Ionac X-236 gyantán (H+) adszorbeáljuk (100 I szürletre 4 I gyantát alkalmazunk), majd az elegyet az adszorpció elősegítésére keverjük. A felülúszót elöntjük és a gyantát 10 gyanta-térfogat, azaz kb. 40 I vízzel mossuk. A mosófolyadékot elöntjük, majd az X-236 gyantát oszlopra töltjük és 5 oszlop-térfogat 0,1 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk. 4 l-es frakciókat gyűjtünk, és az antibiotikum-aktivitást vékonyrétegen, biológiai aktivitás-méréssel és HPLC-vizsgálattal állapítjuk meg. A két A-51568 frakciót tartalmazó eluátum kémhatását 5 n sósav adagolásával pH=7,0-ra állítjuk, majd egyesítjük, és az elegy sótalanítása céljából Diaion HP-20 gyantával töltött oszlopra visszük fel. (5 ) gyanta, az oszlop mérete 10x108 cm) Az antibiotikum aktivitását az előzőekben leírt biológiai módszerrel határoztuk meg. Az oszlopról lejövő oldatot elöntjük, majd a gyantát 5* izopropil-alkoholt és 0,1% foszforsavat tartalmazó, vizes oldattal eluáljuk. 500 mi-es frakciókat szedünk, és az antibiotikum jelenlétét biológiai módszerrel és HPLC-analízissel állapítjuk meg. Az aktív frakciókat egyesítjük, koncentráljuk és liofilizáljuk. A kapott nyers anyag 95% A-51568 A- és 5% A-51568 B-antibiotikumot tartalmaz. A termék tisztítása és az A és B frakció elválasztása elősegítésére az előzőekben nyert 14,7 g liofilizátumot 200 ml ionmentesített vízben vesszük fel, majd CM-Sephadex C-25 gyantával töltött 10x108 cm méretű üvegoszlopra töltjük (NH4+ ciklus, 5 I gyanta, Pharmacia Fine Chemicals Ab, Uppsala, Svédország). Az oszlopot víz és 0,25 n vizes ammónium-hidrogén-karbonát-oldat lineáris gradiensével eluáljuk. 1 l-es frakciókat gyűjtünk, azokat 5 n sósavval semlegesítjük, majd az antibiotikum jelenlétét vékonyrétegen és biológiai méréssel határozzuk meg. Mindegyik frakcióból egy-egy mintát HPLC-módszerrel is vizsgálunk. Az A-51568 A- és/vagy A-51568 B-antibiotikumokat tartalmazó frakciókat két részre osztjuk, az antibiotikumok aránya szerint. Az 1-es számú frakció a 10 és 11. frakcióból áll, melyek az A-és B-faktort hozzávetőlegesen 1:1 arányban tartalmazzák. A 2-es számú frakciót a 12. és 13. 14. 15. és 16. frakcióból képezzük, ez túlnyomórészt az A-faktort tartalmazza. Az 5 így előállított frakciót a fentiek szerint HP-20 gyantán sómentesitjük. Az 1-es számú frakciót 50 ml HP-20 gyantával töltött 0,63 cm-es oszlopra, míg a 2-es számú frakciót 500 ml HP-20 gyantával töltött 3,8x 10 x61 cm-es oszlopra visszük fel. A két oszlopot 5% izopropil-alkohol és 0,1% foszforsav vizes oldatával eluáljuk. 10 ml-es frakciókat szedünk, és biológiai módszerrel és HPLC-módszerrel vizsgáljuk. 15 Az aktív frakciókat egyesítjük és liofilízáljuk. Az előzőekben előállított, 1-es számú frakcióból nyert liofilizált és sómentesített antibiotikum-frakciókat HPLC segítségével 20 kromatografáljuk, és így tiszta A-51563 A- és A-51568 B-antibiotikumokat nyerünk, melyeknek fizikai állandói megegyeznek a leírás bevezető részében megadottal. 2,5 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az (1) általános képletű ,Q - ahol n jelentése 1 (A-51568 A-faktor) vagy 2 (A-51568 B-faktor) - antibiotikumok előállítására, azzal jellemezve, hogy Nocardia orientalis NRRL 15232 mikroorganizmust vagy annak (1) általános képletű antibiotikumot 35 termelő mutánsát vagy variánsát tenyésztjük asszimilálható szénforrást és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, aerob fermentációs körülmények között, és kívánt esetben a keletke- 40 zett antibiotikumot elválasztjuk a fermentléböl. (Elsőbbsége: 1983. 12. 19.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A-51568 A-faktort a fermentléből kinyerjük. (Elsőbbsége: 1982. 12. 45 20.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A-51568 B-faktort a fermentléből kinyerjük. (Elsőbbsége: 1983. 12. 19.) 4 eb rajz A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 16 88.570.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató
