192971. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-51568 A-faktor és B-faktor antibiotikumok előállítására
25 192971 26 A kémhatást nátrium-hidroxid vizes oldatával pH 7,3-ra állítjuk. Sterilizálás után a kémhatás: pH 6,7. A ferde agart beoltjuk a Nocardia orientalis NRRL 15232 spóráival és két napon kérészül inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten. A kifejlődött tenyészetre steril desztillált vizet öntünk, és teril eszközzel ebben elszuszpendáljuk a spórákat és a micéliumot. 1 ml spóraszuszpenzióval oltunk be 50 ml alábbi öszszetételü táptalajt a vegetatív tenyészethez: keményítő dextrin 30.0 g melasz 20.0 g Bacto-pepton (Difco) 7.0 g L-tirozin 1.0 g ionmentes vízzel 1,0 literre töltjük fel. Az oldat kémhatása pH 5,5, amit nátrium-hidroxid vizes oldatával pH 7,0-re állítunk. Sterilizálás után a kémhatás: pH 6,1. A vegetatív inokulumot 250 ml-es, széles szájú Erlenmeyer lombikokban 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, 48 órán keresztül rázatva egy 2,5 cm kitérésű, 250 percenkénti fordulatszámú razógépen. Ezt a tenyészetet használjuk a kis térfogatú fermentorok oltásához (az inokul urn a táptalaj térfogatának 0,8%-a), vagy tovább oltjuk nagyobb térfogatú micélium előállításához. 100 liter alábbi összetételű láptalajt 0,8% (800 ml) fenti vegetatív inokolummal oltunk be. A termelésre szánt tenyészet táptalajának összetétele: polipropilén-glikol (2000) 0.2 g burgonya dextrin 30.0 g melasz 20.0 g Bacto-pepton (Difco) ' 7.0 g L-tirozin 1.0 g ionmentes vízzel 100 literre töltjük fel. Az oldat kémhatása pH 5,2, amit 5 n nátrium-hidroxid oldattal pH 7,1-re állítunk be. A táptalajt 121 °C hőmérsékleten, 1- -1,3 bar nyomáson sterilezzük 45 percen keresztül. Sterilizálás után az oldat kémhatása: pH 6,2. A beoltott táptalajt 165 literes fermentorban fermentáljuk 30 °C hőmérsékleten 114 órán keresztül. A percenként átbuborékoltatott levegő mennyisége a fermentlé térfogatának 0,15-szöröse. A keverést a szokásos keveröberendezéssel végezzük percenként 200-as fordulatszámmal. Az antibiotikus aktivitás a fermentlé felülúszójában található. Az antibiotikum menynyiségének mérésére a fermentlé mintákat 1000 g-én lecentrifugáljuk, és a felülúszót vizsgáljuk. A felülúszót pH 6,0 kémhatású foszfátpufferrel hígítjuk és mikrobiológiailag mérjük az aktivitást agar lemezen, Micrococcus luteus ATCC 9341 mikroorganizmust használva. 2. példa Az alábbiakban ismertetjük az A-51568 antibiotikum keverék kinyerését. 3 liter fermentléhez, mely az A- és B-faktort 95:5 arányban tartalmazza, szűrési segédanyagot (Hyflo Supercel diatómaföld, Johns-Manville Corp.) adunk, és a keveréket leszűrjük. A 2,7 I térfogatú, pH 7,8 kémhatású szűrletet Diaion HP-20 gyantával (gyöngy formájú, nagyporozitású, sztirol-divinil-benzol kopolimer, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Tokió, Japán) töltött, 3x25 cm-es kromatográfiás oszlopra visszük. Az effluenst eldobjuk, és az oszlopot 1 liter vízzel, majd 500 ml 25%-os metanollal mossuk. Az A-51568 antibiotikum keveréket kétszer 500 ml 50*-os vizes metanollal eluáljuk az oszlopról. Az A- és B-faktor azonos módon adszorbeálódik a HP-20 gyantán és azonos körülmények között is eluálódik róla, ezért a faktorok nem választhatók el ennél a lépésnél. Az eluciós faktorok antibiotikus aktivitását B. Subtilissei vizsgáljuk. A legaktívabb frakciókat kis térfogatra koncentráljuk és liofilizáljuk. 905 mg nyers A-51568 antibiotikum keveréket nyerünk, melyben az A- és B-faktorok aránya 95:5 3. példa Az alábbiakban az A-51568 antibiotikum keverék tisztítását írjuk le. A 2. példában leírtak szerint nyert 905 mg nyers A-51568 antibiotikum keveréket 50 ml vízben oldjuk és Sephadex CM-25 (NH4+ ciklusú) (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Svédország) gyantával töltött 1,7x x44 cm-es kromatográfiás oszlopra visszük. Az effluenst eldobjuk, és az oszlopot 250 ml vízzel mossuk. Az oszlopot konvex grádiensü ammónium-hidrogén-karbonát oldattal (víz -> 1 M NH4HCO3; 100 ml-es keverőkamra) eluáljuk. 25 ml-es frakciókat gyűjtünk és az antibiotikus aktivitásukat B. subtilisszel vizsgáljuk. Az aktív frakciókat összeöntjük. Minthogy a Sephadex CM-25 gyantán nem egyformán adszorbeálódik és eluálódik az A- és B-faktor, az A-faktorban gazdag frakciók nem azonosak a B-faktorban gazdag frakciókkal. Minthogy a B-faktor az A-faktorhoz képest lényegesen kisebb mennyiségben van a keverékben, a B-faktorban gazdag frakciók viszonylag alacsony antibiotikus aktivitást mutatnak az A-faktorban gazdag frakciókhoz képest. Az egyesített frakciók ezért viszonylag kevés B-faktort tartalmaznak. A termék sótalanitása céljából az összegyűjtött frakciókat 1,7x10 cm méretű, vízzel ekvilibrált 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14
