192960. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lankacidin-termelés fokozására
11 192960 12 (1 levegő térfogat/perc/táptalaj-tér fogat) éa keverés (165 fordulat/perc) mellett inkubáljuk. 60 1 fentebb kapott tenyészethez 20 1 vizet és 2 kg Hyflo-Supercel-t (Johns Manville Products Corp., Amerikai Egyesült Államok) adunk, és az elegyet leszűrjük. 70 1 szűrletet kapunk. A szűrlet egy részét megvizsgálva úgy találtuk, hogy 3,3 mmól/1 lankacidin C-t és 0,2 mmól/1 lankacidin A-t tartalmaz. A 70 1 szűrletet 200 1-es, keveróvel ellátott edénybe visszük, hozzáadunk 35 1 etil-acetátot, és az elegyet szobahőmérsékleten 30 percen keresztül 120 fordulat/perc sebességgel keverjük, majd az elegy egy részéből újra meghatározzuk a lankacidinek mennyiségét. A mintában nem találtunk lankacidin C-t, csak lankacidin A-t. Az elegyet ezután további 1 órán keresztül keverjük, majd az etil-acetátos fázist elválasztjuk, rotációs bepárlón 5 1-re töményítjük (belső hőmérséklet 30 °C) A koncentrátumot 10 kg, toluollal ekvilibrált szilikagélen (0,05-0,2 mm; Merck Co., Amerikai Egyesült Államok) adszorpciós kromatográfiás módszerrel tisztítjuk. Az oszlopot 30 1 toluollal, majd 120 1 toluol-etil-acetát (8:2) eleggyel eluáljuk. Minden egyes eluátumból 1 1-es alikvotokat gyűjtünk, a biológiailag hatásos frakciókat rotációs bepárlón bepároljuk (belső hőmérséklet 30 #C), kristályos maradékot kapunk. A kristályokat megszárítva 80,0 g kristályos lankacidin A-t kapunk. 6 6. példa 3 vegyes% glükózt, 1 vegyes% Proflo-t, 3,5 vegyest kukoricalekvárt, 0,02 vegyes% magnézium-szulfátot, 0,1 vegyes% dikálium-hidrogón-foszfátot és 1,5 vegyeB% kalcium-karbonátot tartalmazó táptalajhoz 20 vegyes%-os vizes nátriura-hidroxid-oldatot csepegtetve a táptalaj pH-ját 6,5-re állítjuk. 25 ml fenti táptalajt 200 ml-es Brlenmeyer-lombikba mérünk, vattával lezárjuk és sterilezzük. A táptalajt egy kacs ferde agaron tenyésztett Streptomyces violaceoniger (IFO-14 166) tenyészettel beoltjuk és 28 °C-on 200 fordulat/perc sebességű rotációs rázógépen 24 órán keresztül rázatjuk. Az így kapott tenyészetet inokulumként használjuk. 10 vegyes% glicerint, 2 vegyest Proflo-t, 0,5 vegyest kukoricalekvárt, 1 vegyes% Polypeptont, 0,1 vegyeB% vas-szulfátot, 0,0025 vegyes% réz-szulfátot és 0,5 vegyes% nátrium-kloridot tartalmazó táptalajhoz az 5. táblázatban feltüntetett mennyiségben ß-ciklodextrint adunk. A táptalaj pH-ját 6,5-re állítjuk, cseppenként adagolt 20 vegyes%-os vizes nátrium-hidroxid-oldattal. 25 ml fenti táptalajt 200 ml-es Erlenmeyer-lombikba viszünk, majd 120 °C-on 20 percen ót sterilezzük. A táptalajt 1 ml inokulummal beoltjuk, majd 24 °C-on 200 fordulat/perc sebességű rotációs rázógépen 96 órán keresztül rózatjuk. A táptalajban felhalmozódott lankacidinek mennyiségét az 1. példában ismertetett módszerrel határozzuk meg. Az eredményeket az 5. táblázatban közöljük. 5. táblázat Táptalaj- Lankacidin C Lankacidinol hoz adott (mmól/1) (mmól/1) 0-ciklodextrin koncentrációja (mmól/1) 0 0.40 0.06 2.25 2.55 0.78 4.5 3.76 0.80 9 4.60 1.25 13.5 4.04 2.33 18 4.01 2.66 7. példa 10 ml 6. példa szerinti, 9 mmól/1 jj-ciklodextrint tartalmazó tenyészetet (lásd 5. táblázat) szobahőmérsékleten 2000 fordulat/perc sebességgel centrifugálunk. 6 ml felülúszót 100 ml-es, dugós Erlenmeyerlombikba viszünk, és 6 ml etil-acetátot adunk hozzá. Az elegyet 18 °C-on 30 percen keresztül 200 fordulat/perc sebességgel keverjük, az acetilezés elősegítése céljából. Az etil-acetátos fázist 50 ml-es választótölcsérben elválasztjuk, majd meghatározzuk a lankacidinek mennyiségét-az 1. pélában leírt módszerrel. Az eredmények a 6. táblázatban láthatók. 6. táblázat Lankacidinek Reakciótermék ciója (mmól/1) koncentrá-Lankacidin A Lankacidinol A 4.55 1.21 8. példa A tenyésztést a 6. példában leírtak szerint végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a Streptomyces violaceoniger (IFO-14 166) helyett Streptomyces sp. 6642-GCi-et (1F0--14 172) használunk. A táptalajban felhalmozódott lankacidinek mennyiségét az 1. példában leírtakkal azonos módon határozzuk meg. Az eredményeket a 7. táblázatban foglaljuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
