192955. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkoxi-benzoil-csoporttal acilezett A- 21978C ciklusos peptid-származékok előállítására
11 192955 12 juk 5 cm átmérőjű ív körül percenként 250 forgást végző rázógépen. Az inkubált, fentebb leírtak szerint előállított második fokozatú vegetatív táptalajjal (80 ml) beoltunk 10 liter steril szaporító táptalajt, melynek összetétele az alábbiak valamelyike: I. táptalaj Alkotórészek Mennyiség (g per.l) Földimogyoróliszt 10.0 Oldható hús-pepton 5.0 Szacharóz 20.0 KH2PO4 0.5 K2HP04 1.2 MgS04.7H20 0.25 Csapvíz 1 literig. 121 °C-on 45 percig mintegy 110— -124 kPa nyomáson végzett autoklávozás után a táptalaj pH-ja körülbelül 6,9. II. táptalaj Alkotórészek Mennyiség (g per ! Szacharóz 30.0 Pepton 5.0 KjHP04 1.0 KC1 0.5 MgS04.7H20 0.5 FeS04.7H20 0.002 Ionmentesített víz 1 literig. A pH-t HCl-val 7,0-re állítjuk be; autoklávozás után a pH körülbelül 7,0. III. táptalaj Alkotórészek Mennyiség (g per 1) Glükóz 20.0 NH4C1 3.0 Na2S04 2.0 ZnCl2 0.019 MgCl2.6H20 0.304 FeCU.6H20 0.062 MnClí4H20 0.035 CuCl2,2H20 0.005 CaCOa 6.0 KH2P04* 0.67 Csapvíz 1 literig. ’Külön sterilizálva és fertőző anyagoktól mentesen hozzáadva. Végső pH körülbelül 6,6. A beoltott szaporító táptalaj fermentációját 14 1-es fermentorban mintegy 30 °C-on körülbelül 66 óráig folytatjuk. A fermentációs közeget szokásos keverőkkel körülbelül 600 ford/nrn sebességgel keverjük és steril levegővel levegőztetjük úgy, hogy az oldott oxigén szintjét 30%-os levegőtelítés felett tartsuk légköri nyomáson. B. Az 4-21 978C dezac.ilezése Aí A.utahensis fermentációját az A. fejezetben leírtak szerint hajtjuk végre ferde A táptalajt és I. szaporító táptalajt használva és a szaporító táptalajt mintegy 67 óráig inkubálva. A fermentációs közeghez nyers A-21 978C komplexet adunk (100 g) (előállítva a 4 2(8 403 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint). f z A-21 978C komplex dezacilezését Micrococcus luteus-szal végzett próba segítségével követjük. A fermentációt teljes dezacileződésig folytatjuk; ezt a JW. luteus-szal szemteni aktivitás eltűnése jelzi (körülbelül 24 óra). C. Az A-21 978C mag izolálása \ B. fejezetben leírtak szerint kapott teljes fermentlevet (20 liter) szűrési segédanyaggal (Hyflo Super-Cel, John Manville Corp.) átszűrjük. A micélium eltávolítása után a szí'rt levet 1,5 liter HP-20 gyantát (DIAION High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át. A kapott effluent t elöntjük. Az oszlopot ionmentes ítélt vízzel (10 liter) mossuk a szűrtlé maradékának eltávolítása céljából. A mosófolyadékot elönljük. Ezután az oszlopot 10-10 liter térfogatú viz/acetonitril elegyekkel (95:5, 9:1 és 4:1) eluáljuk, 1 literes frakciókat gyűjtve. Az eluciót papírkromatográfiával ellenőriztük, n-butanol/piridin/ecetsav/víz (15:10:3:12) oldószerrendszert használva és a vegyületeket UV fluoreszenciával detektálva. E rendszerben az A-21 978C faktorok Rf-értéke körülbelül 0,56 és az A-21 978C mag Rr-értike körülbelül 0,32. A termék analitikai HPLO-vel is ellenőrizhető, fordított fázisú szili kagél/Crs adszorbenst és 0,1% ammónium-acetátot tartalmazó víz/metanol (3:1) oldószer rendszert használva, a magot UV monitorral 254 nin hullámhossznál detektálva. A magot tartalmazó frakciókat egyesítve, az acelonitrilt vákuumban lepárolva és a maradékot fagyasztással szárítva 40,6 g félig tisztított A-21 978C magot kapunk. D. Az A-21 978C mag tisztítása A C. fejezetben leírtak szerint kapott félig tisztított magot (15 g) 0,2% ecetsavat és 0,8% piridint tartalmazó 75 ml víz/metanol/ /acatonitril (82:10:8) elegyben oldjuk. Az oldatot 3,33 liter szilikagél/Cis/Quantum LP-1, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
