192892. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-d-glükonsav-reduktáz előállítására
16 19289: 17 II) Ioncserélő kromatográfia Az enzimoldatokat az 1. példa 3) ii) részében leírt módon kezeljük. Az így kapott eluátumok enzimaktivit ;sa a következő: Törzs Az enzimoldatok mennyisége Protein A 25DKG-reduktóz aktivitása K-106 49 ml 0.60 rag/ml 2.4 egység/ml T-13 52 ml 0.94 mg/ml 4.1 egység/ml III) Affinitás-kromatográfia A fenti ii) rész szerint kapott mindkét eluátumhoz 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, és az enzimeket az 1. példa 3)iv) részben leírtak szerint Phenyl Sepharose gél oszlopon kromatografálva koncentráljuk és BÓmentesítjük. A koncentrált enzimoldatokat az 1. példa 3)iii) részében leírtak szerint Amicon Matrix Gel Red A oszlopon affinitás-kromatogréfiával kétszer tisztítjuk. A mindkét törzsből származó 25DKG-reduktázt frakciókat szedve eluáljuk, az ^ eluens 0,7-1 mólos nátrium-klorid az első kromatografálásnál és 0,5 mmól NADPH-t tartalmazó fenti eluens a második kromatografálásnál. Az eluátumokat az 1. példa 3)iv) részé- 2° ben leírtak szerint a NADPH eltávolítása után sómentesítjük és koncentráljuk. Ennek eredményeképpen a tisztított enzimoldatok a következő aktivitásokkal rendelkeznek: Törzs Az enzimoldatok Protein A 25DKG-reduktáz mennyisége aktivitása K-106 kb. 1 ml 0.25 mg/ml 23.8 egység/ml T-13 kb. 2 ml 0.17 mg/ml 15.1 egység/ml Az így kapott enzimoldatok 2-10 jul mennyiségeit az 1. példa 4) részében leírtak szerint SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel 35 és izoelektromos pont-elektroforézissel vizsgáljuk. Mindkét enzim egyetlen sávot mutat. A tisztított enzimoldatokból a következő jellemzőket határozzuk meg. 40 4) Az enzimek fizikai-kémiai tulajdonságai A fizikai-kémiai tulajdonságok mérését az 1. példa 4)-5) részei szerint végezzük. 45 I) Molekulasúly A molekulasúly meghatározását SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel végezzük. Azt találjuk, hogy mind a K-106, mind a T-13 50 törzsből származó 25DKG-reduktáz molekulasúlya 29.000±2.000. II) Izoelektromos pont 55 A K-106 és T-13 törzsekből származó enzimek izoelektromos pont-elektroforézisének eredményeképpen az izoelektromos pontok 4,4±0,2 illetve 4,5±0,2 pH-értéken vannak. 60 III) Fajlagosság a szubsztrátumra Mindkét enzim csak Ca-2KLG-at termel Ca-25DKG-ból és csak L-szorbózt 5KF-ból. Semmit sem termelnek az 5-keto-l)-glükonsav, D-fruktóz, L-szorbóz, 2-KLG és 2-kolo-D- glükonsav szubsztrátuinokból. IV) Enzimaktivitás A K-106 törzsből származó enzim aktivitása Ca-25DKG-ra 23,8 egység/ml (95 egység/mg protein) és az 5KF-ra 38,3 egység/ml (152 egység/mg protein). A T-13 törzsből származó enzim aktivitása azonban Ca-25DKG- ra 15,1 egység/ml (89 egység/mg protein) és 5KF-ra 39 egység/ral (229 egység/mg protein). V) Koenzim (hidrogén-donor) Mindkét enzim enzimaklivitását mérve Ca-25DKG-ra koenzimként NADH-ot használva, azt találtuk, hogy az aktivitás minden esetben 0,1 egység/ml vagy ennél kisebb. VI) Optimális pH-érték A K-106 és T-13 törzsekből kapott 25DKG-reduktázok enzimaktivitásait mérjük különböző, 4-9 pH közötti, változó értékeken. A szubsztrátum Ca-25DKG, a hőmérséklet 30 “C. Az eredményeket a 6. táblázat szemlélteti. 10
