192892. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-d-glükonsav-reduktáz előállítására
10 192892 1 i 5) A fizikai-kémiai tulajdonságok mérése I) Enzimreakció 10 3) szerint kapott tisztított enzimoldatot 25 /umól azubsztrátummal <Ca-25DKG vagy 5KF) és 15 /umól NADPH-ot tartalmazó 3,0 ml 0,01 mólos trisz-pufferral (pH = 7) keverünk, és a keveréket 30 "C-on 60 percig reagáltatjuk. A reakció befejeződése után a reakciókeveréket papírkromatográfiával (kifejlesztő oldószer; fenol—hangyasav— -viz, 75:4:25, előhívás az úgynevezett AHF-oldattal, amit úgy készítünk, hogy 0,93 g anilint és 1,66 g ftálsavat 100 ml, vízzel telített n-butanolban feloldunk, és az oldatot 105 °C-on 2 percig melegítjük) és gázkroma- J tográfiával (oszlop: SE-52, vivőgáz: hélium, minta: trimetil-szililezelt származék) analizáljuk. Az analízisek eredményeképpen mindkét kromatográfiás vizsgálatnál azt találtuk, hogy a 25DKG-ból csak 2KLG és az 5KF-ból ^ csak L-szorbóz képződik. Az 1. táblázat a termékek gázkromatográfiás kvantitatív vizsgálatának az eredményeit tünteti fel. 1. táblázat 25DKG ás 5KF redukciója tisztított enzimoldattal Szubsztrátum Termek A termék koncentrációja Ca-25DKG Ca-2KLG 845 /ul/ml 5KF L-szorbóz 795 /ul/ml II) Fajlagosság a szubsztrátumra 0,3 /umól NADPH-ot tartalmazó 2,9 ml 0,1 mólos trisz-puffert (pH-7) 1 cm optikai hosszúságú kvarc küvettába teszünk és 1- -5 jul, a 3) rész Bzerint előállított enzimoldatot adunk hozzá. Az Így kapott keverékhez adjuk a különböző szubsztrátumok 0,1 mólos oldatainak 0,1 ml-ét, a reakciókeveréket 30 °C hőmérsékleten tartva. Az enzim reaktivitását az illető szubsztrátumra a 340 nm-en mért abszorpció csökkenésének folyamatos 30 mérésével határozzuk meg, az 1 perc alatt végbemenő csökkenés alapján. A mérés eredményeit a 2. táblázat szemlélteti. 2. táblázat A 25DKG-reduktáz fajlagossága különböző szubsztrátumokra Szubsztrátum A tisztított enzimoldat (1 ml) aktivitása Ca-25DKG 54 egység 5KF 94 egység K-5-keto-glükonát 0 egység D-fruktóz 0 egység L-szorbóz 0 egység Ca-2-keto-D-glükonát 0 egység Na-2KLG 0 egység A fenti táblázatból nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti enzim nagy aktivitást mutat 25DKG-ra és 5KF-ra, de egyáltalán nem gyakorol redukáló hatást 5-keto—D—glükon— savra, D-fruktózra, L-szorbózra, 2-keto-D-glükonsavra és 2KLG-ra. III) Koenzim (hidrogén-donor) Az 5)ii) szerinti reakciórendszerben 35 a NADPH-ot NADH-dal helyettesítjük, és a 25DKG-reduktáz enzimaktivitását mérjük Ca-25DKG és 5KF szubsztrátumokra. Az eredményeket a 3. táblázat szemlélteti. 7
